2.2.1 Vật liệu thí nghiệm
2.2.1.1. Nguồn cơ chất
Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei (S. mcc A) và
Turbinaria ornata (T. o A) được cung cấp bởi phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. S. mcc A có KLPT 505 kDa, T. o A có KLPT 325 kDa được xác định bằng phương pháp sắc ký GPC (Phụ lục 1), hàm lượng uronic acid tổng số lớn hơn 90%.
2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểmcủa vùng biển Khánh Hòa ở độ sâu 3-5m vào tháng 4/2021 (hình 2.1). Các mẫu rong biển sau khi được thu thập, phân loại được cho vào túi trữ mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 4ºC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Quá trình thu mẫu đã thu được 05 mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa (hình 2.1) gồm: (1) rong Hormophysa articulate, (2) rong Sargassum oligocystum, (3) rong Turbinaria ornata, (4) rong Padina australis, (5) rong
Sagassum polycystum.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ: - Đĩa petri - Que cấy trang - Que cấy vòng
- Ống Cryotube để giữ giống
- Các loại ống đong 100ml; 500ml;1000ml - Bình tam giác 500ml; 1000ml
- Pipet
- Nước biển vô trùng đựng trong bình tam giác
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Cân phân tích CP224S Sartorius 31
- Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ
- Máy đo quang: SHIMADZU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER
2.2.3. Môi trường nuôi cấy.
Môi trường phân lập MBA: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:
- Pepton: 10g - Alginate: 10g - KH2PO4: 0,1g - MgSO4.7H2O: 0,1g - Nước cất: 500ml - Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển
Môi trường MB lỏng để lưu giữ giống: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:
- Pepton: 5g
- Alginate chiết từ rong S. mcclurei: 10g - Yeast extract: 1g
- KH2PO4: 0,1g - MgSO4.7H2O: 0,1g - Nước cất: 500ml - Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển
Môi trường MBA lỏng để lên men vi khuẩn: Các thành phần cho 01
lít nước bao gồm: - Pepton: 5g
- 0,5%Alginate chiết từ rong S. mcclurei: 5g - Yeast extract: 1g
- KH2PO4: 0,2g
- MgSO4.7H2O: 0,05g - Nước cất: 500ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển
Thuốc thử Gram’s iodine để thử nghiệm hoạt tính enzyme:
Gram Iod (IX):
- Kali iodide (KI): 2g - I2: 1g
- Nước cất: 300ml
- Cetavlon (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) 10% (stock):
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài đã được thực hiện theo sơ đồ tổng quát Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài
2.3.1. Xử lý mẫu
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểm của vùng biển Khánh Hòa được cho vào các túi zip, mỗi mẫu rong được cho vào mỗi túi và bảo quản ở nhiệt độ 15-200C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Các mẫu rong nâu sau khi được thu đưa về phòng thí nghiệm sẽ được tiến hành xử lý mẫu ngay trong ngày, các mẫu sẽ được phân loại, chụp hình,
Thu và xử lý các mẫu rong nâu
Phân lập vi khuẩn biển theo định hướng sinh
alginate lyase
Sàng lọc chủng hoạt tính cao để định danh
Lên men, thu nhận, xác định đặc tính xúc tác
Bộ sưu tập vi khuẩn biển nguồn gốc từ rong nâu
Bộ sưu tập vi khuẩn biển sinh alginate lyase
Dữ liệu 16S rDNA
Lên men thu nhận enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của ion hóa trị II Ảnh hưởng của NaCl
mã hóa, trích mẫu định danh (Hình 2.2). Phần mẫu còn lại sẽ được sử dụng để phân lập vi khuẩn biển. Mẫu rong được rửa ba lần với nước biển vô trùng để loại bỏ vi sinh vật ngoại nhiễm, sau đó sử dụng cối sứ đã được vô trùng nghiền nát để thu dịch mẫu (xem phụ lục 1 các Hình P 3, Hình P 4).
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển
Phương pháp phân lập vi khuẩn từ các mẫu rong nâu được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Thuận và cộng sự [84]. Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ Hình 2.3. Cụ thể:
Một gam (g) mẫu được đồng nhất với 10ml nước biển vô trùng. Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. Cấy trang 100µl mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 dịch lên đĩa thạch chứa môi trường phân lập có bổ sung alginate từ rong S. mcclurei làm nguồn carbon chỉ thị (MBA). Để phân lập vi khuẩn biển đĩa thạch MBA được ủ ở 30oC. Sau 1-5 ngày, khuẩn lạc rời có đặc điểm hình thái khác nhau được cấy chuyển trên môi trường MB (không có chứa alginate) để có khuẩn lạc thuần, đơn lẻ.
Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Mỗi khuẩn lạc rời được cấy chuyển ít nhất 3 lần để đảm bảo về độ thuần chủng. Vi khuẩn được gọi là thuần khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.
Chủng vi khuẩn thuần chủng được mã hóa và lưu giữ trong môi trường MB lỏng (không có chứa agar) bổ sung 30% glycerol (v/v), giữ ở - 80oC thuộc bộ sưu tập vi sinh vật biển của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn biển từ rong biển 2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khả năng sinh chuyển hóa alginate của các vi khuẩn đánh giá bằng phương pháp đĩa thạch chứa cơ chất mục tiêu là S. mcc A [52]. Cụ thể, Lấy một khuẩn lạc của vi khuẩn thuần chủng cấy lên đĩa thạch alginate, mỗi đĩa thạch cấy ít nhất 5 chủng vi khuẩn, các đĩa vi khuẩn được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Sau đó, sinh khối tế bào được loại bỏ khỏi bề mặt thạch
Rong biển
Rửa bằng nước biển vô trùng
10 ml nước biển+ 1g mẫu rong
Nghiền nát mẫu thành dịch huyền phù, pha loãng
Hút 100 µl dịch vào môi trường MBA
Kiểm tra và quan sát
Cấy chuyển làm thuần chủng vi khuẩn trên môi trường MB
Chọn chủng vi khuẩn, giữ mẫu ở - 80oC
Ủ ở 30°C từ 1-5 ngày
bằng que cấy, sửa sạch sinh khối trên mặt thạch bằng nước cất. Tiến hành đổ ngập mặt thạch thuốc nhuộn Gram’s iodine trong 25 phút. Chủng vi khuẩn được xác định là có khả năng sinh alginate lyase khi vùng thử nghiệm của chúng không bị nhuộm màu bởi thuốc nhuộm mà tạo ra vùng trong suốt (vòng phân giải). Chủng vi khuẩn biển tạo ra vòng phân giải alginate với đường kính lớn nhất và rõ ràng nhất được lựa chọn để định danh.
2.3.4. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được lựa chọn để định danh bằng phương pháp so sánh trình tự gen 16S rRNA. Sử dụng cặp mồi 533F:
5’GTGCCAGCAGCCGCGGTAA3’ và 1496R:
5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’ để nhân gen mã hóa đoạn 16S rRNA của vi khuẩn phân lập được. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, tinh chế bằng bộ QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Trình tự nucleotide của gen 16S rRNA tinh sạch được giải bằng phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI 3130XL (313001R, Thermo Fisher Scientific, USA) tại Phòng xét nghiệm Công ty TNHH DV và TM Nam Khoa (Thành phố Hồ Chí Minh). Các trình tự được xử lí bằng các chương trình BLAST/NCBI và tiến hành so sánh trình tự gen của các chủng nghiên cứu với một số chủng khác từ Ngân hàng gen thế giới (National Center for Biotechnology Information/NCBI) [83].
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate
2.3.5.1. Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase
Chủng vi khuẩn biển đã tuyển chọn được lên men như sau: Chủng vi khuẩn thuần chủng được lên men trong 200 ml môi trường MBA lỏng có chứa: yeast extract 0,8 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; MgSO4.7H2O 0,05 g/l; nước biển 500 ml, nước máy 500 ml và 0,5g/l alginate chiết từ rong S. mcclurei; pH= 5,5 ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ với tốc độ lắc 180 vòng/phút [85].
Dịch lên men sau 18 giờ, đem đi ly tâm 6.000rpm trong 30 phút ở 10oC. Thu dịch nổi để kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào. Phần sinh khối
được huyền phù hóa lại với đệm Tris HCl 0,02 M pH 7,0. Sau đó ly tâm 6000rpm trong 30 phút ở 10oC để loại bỏ hoàn toàn dịch ngoại bào. Thu lại sinh khối, cấp đông qua đêm để tăng hiệu suất phá vỡ tế bào. Tái huyền phù với đệm Tris HCl 0,02M pH 7,0 phá vỡ tế bào bằng sonication, ly tâm 6000rpm trong 30 phút ở 10oC để phá vỡ thành tế bào thu dịch enzyme nội bào. Kiểm tra hoạt tính alginate lyase của dịch ngoại bào và nội bào. Lựa chọn phần có hoạt tính cao để tiến hành bước tinh sạch sơ bộ tiếp theo tiếp theo [85].
2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn
Dịch enzyme ngoại được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa với muối (NH4)2SO4. Đây thường là bước đầu tiên để tinh sạch alginate lyase từ vi khuẩn biển [85], cụ thể như sau: Dịch chiết thô enzyme được tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 80%. Thực hiện kết tủa trong 24 giờ ở 4oC, sau đó li tâm 30 phút ở nhiệt độ 10oC, 12.000rpm và thu nhận phần tủa. Sau đó phần kết tủa được huyền phù lại trong 20ml đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5. Thẩm tách dịch huyền phù qua màng thẩm tách 10kDa trong đệm, ở nhiệt độ 4oC, qua đêm để loại muối (NH4)2SO4.
Thử nghiệm hoạt tính enzyme: Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl enzyme đã pha loãng ở nồng độ 0,1 mg protein/ml và 1900µl S. mcc A nồng độ 10mg/ml pha trong đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 và 200 mM NaCl. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó, dừng phản ứng bằng cách thêm 20 µl NaOH 10M. Ghi nhận bước sóng 235 tại thời điểm 0 phút và 30 phút. Hoạt tính alginate lyase được tính bằng sự gia tăng bước độ hấp thụ ở bước sóng OD235 [3]. Một đơn vị hoạt tính (U) được xác định là lượng enzyme cần thiết để gia tăng độ hấp thụ tại bước sóng 235 nm lên 0,1 trong 1 phút.
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry[85] với chuẩn là albumin.
+ Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N + Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất + Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất
- Lấy 0,5ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25ml Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 660 nm. Dùng Albumin huyết thanh bò (BSA) để xây dựng đường chuẩn (Hình 2.3).
Hình 2.4. Đường chuẩn albumin
2.3.5.3. Phương pháp xác định đặc tính xúc tác của enzyme
Một số đặc tính của enzyme được xác định như sau:
Xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được tiến hành bằng cách thực hiện phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau từ 25 đến 70oC trong 30 phút. Tại điểm nhiệt độ có hoạt tính cao nhất được quy đổi thành 100% hoạt tính, các điểm nhiệt độ còn lại hoạt tính được tính dựa trên mối tương quan với điểm có hoạt tính cao nhất [3]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
y = 0.003x - 0.016 R² = 0.9945 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0 50 100 150 OD 660 Nồng độ albumin (µg/ml)
Xác định pH tối ưu của enzyme: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của alginate lyase được xác định bằng cách tính hoạt tính alginate lyase ở các pH khác nhau từ 5-8. Tại điểm pH có hoạt tính cao nhất được quy đổi thành 100% hoạt tính, các điểm pH còn lại tính % hoạt tính còn lại tương quan với hoạt tính tại điểm có hoạt hoạt tính cao nhất.
Xác định ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính enzyme: 1ml enzyme được bổ sung EDTA với nồng độ 1mM, giữ hỗn hỗn hợp ở 4oC, trong vòng 2 giờ. Sau đó tiến hành loại bỏ phức EDTA-ion kim loại bằng cột PD10 (17085101, Cityva, GE), rửa giải bằng dung dịch đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5. Để xác định hoạt tính của ion kim loại đến hoạt tính enzyme, các ion kim loại gồm Ca2+, Mg2+, Mn2+, C2+, Ni2+, Zn2+ với nồng độ 10 mM trong hỗn hợp phản ứng. Hoạt tính enzyme khi enzyme không có mặt của ion kim loại được tính là 100%, hoạt tính enzyme khi bổ sung ion kim loại được tính dựa trên mối tương quan với mẫu không có ion kim loại.
Xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu nhận được:
Xác định khả năng phân cắt mạch alginate chiết từ rong S. mcclurei và T. ornata của alginate lyase bằng phương pháp điện di trên gel Carbohydrate – Polyacrylamide gel electrophoresis (C-PAGE): Hỗn hợp phản ứng (0,1mg/ml enzyme, 4mg/ml S. mcc A/T. o A) được ủ ở điều kiện tối ưu. Dừng phản ứng bằng cách làm nóng ở 85oC trong 10 phút. 10 μL của sản phẩm thủy phân được trộn đều với 10 μL dung dịch đệm mẫu (10% glycerol trong nước và 0,02% phenol red). Mẫu (10 μL) được đưa lên gel điện di 20% (w/v) polyacrylamide pha trong đệm 150 mM Tris-HCl, pH 8,8. Độ dày gel 1mm. Quá trình điện di được thực hiện trong 45 phút, 20mA. Sau khi kết thúc điện di, tiến hành nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm có chứa 0,01% O-toluidine blue trong ethanol, acid acetic và nước với tỷ lệ thể tích 2:1:1 trong 1 giờ. Sau đó, giải nhuộm bằng cách ngâm và rửa gel nhiều lần trong nước cất đến khi thấy xuất hiện các vạch trên gel [86].
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Tất các các thí nghiệm thực hiện hoạt tính enzyme đều được thực hiện 3 lần, kết quả được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình (Mean) ± sai số (SD). Đồ thị được vẽ trên Excel.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Từ 05 loài mẫu rong biển thu được ở Khánh Hòa (được trình bày ở Bảng 2.1) theo định hướng tìm kiếm vi khuẩn biển có khả năng sinh enzyme thủy phân alginate, chúng tôi đã phân lập các chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường có chứa nguồn carbon duy nhất là alginate chiết xuất từ rong S. mcclurei (Hình 3.1).
Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập từ mẫu rong S. oligocystum
mọc trên đĩa môi trường MBA
Dựa vào đặc điểm khuẩn lạc như: màu sắc, kích thước, hình thái bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn biển mọc trên đĩa thạch, thí nghiệm phân lập được 47 chủng vi khuẩn biển có sự đa dạng về kích thước, màu sắc, hình thái bề mặt được trình bày ở Hình 3.3 và Bảng 3.1.
Hình 3.3. Số lượng chủng vi khuẩn biển phân lập được từ các nguồn
rong nâu
Trong 47 chủng vi khuẩn biển phân lập được, rong Padina australis
phân lập được 13 chủng chiếm số lượng lớn nhất (28%), rong S. oligocystum
phân lập được 12 chủng (26%), rong T. ornata phân lập được 10 chủng (21%), rong H. articulata phân lập được 6 chủng (13%), rong S. polycystum
phân lập được 6 chủng (13%). 0 2 4 6 8 10 12 14
P. australis S. oligocystum T. ornata H. articulata S. polycystum
Nguồn phân lập
Số lượng chủng vi khuẩn
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm phân lập các chủng vi khuẩn biển TT Kí hiệu chủng Hình ảnh khuẩn lạc Hình dạng Kích