STT
Chủng nghiên
cứu
Trình tự tương đồng (tên chủng) Độ che phủ (%) % tương đồng Mã số Genbank 1 R4BF4 Bacillus velezensis strain NN04 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT114570.1
Bacillus velezensis
strain AAB15 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MG573218.1
Bacillus velezensis
strain G341 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MF167634.1
Bacillus velezensis
strain EBR2 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT916167.1
Bacillus velezensis
strain B6-2 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT804559.1
2 R7BF4
Cobetia marina strain WAB2104 16S
ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 MH169273.1
Cobetia marina strain 0402 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 MH000018.1
Cobetia marina strain KW30-8-3 16S
ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 JQ670742.1
Cobetia marina strain Alix5 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
3 R8BF10
Bacillus velezensis
strain gp-4 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MK641661.1
Bacillus velezensis
strain VMFR14 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MZ234617.1
Bacillus
amyloliquefaciens
strain L51 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 KU551169.1
Từ kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi so sánh chủng vi khuẩn R4BF4 được phân lập từ rong S. oligocystum với 5 chủng: Bacillus velezensis NN04,
B. velezensis AAB15, B. velezensis G341, B. velezensis EBR2, B. velezensis
B6-2, có tỷ lệ tương đồng lên đến 100%. Như vậy, từ sự so sánh trên có thể khẳng định chủng vi khuẩn R4BF4 thuộc chi Bacillus. Từ đó có thể định danh tên loài chủng vi khuẩn biển phân lập được R4BF4 là Bacillus velezensis
R4BF4.
Chủng vi khuẩn R7BF4 được phân lập từ rong B. polycystum có độ tương đồng 99,86% với 3 chủng Cobetia marina WAB2104, C. marina 0402,
C. marina KW30-8-3. Tương đồng 99,78% với 1 chủng C. marina Alix5. Điều đó chúng tỏ chủng vi khuẩn R7BF4 thuộc chi Cobetia. Từ đó có thể định danh tên loài chủng vi khuẩn biển phân lập được R7BF4 là Cobetia sp. R7BF4.
Đối với chủng vi khuẩn biển R8BF10 được phân lập từ rong Turbinaria ornata thì so sánh với 5 chủng: B. velezensis gp-4 16S, B. velezensis
VMFR14 16S, B. amyloliquefaciens L51 có tỷ lệ tương đồng 100%. Như vậy, chủng vi khuẩn biển R8BF10 thuộc chi Bacillus. Tên định danh của chủng vi khuẩn biển phân lập được R8BF10 là Bacillus velezensis R8BF10.
Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của 03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI được trình bày ở phụ lục 2.
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài.
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen vùng 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển theo phương pháp Neighbor Joining bằng phần mềm MEGA 11 với vòng lập 1000 lần. Giá trị Bootstrap value được biểu hiện trên các nhánh.
Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA của các
chủng vi khuẩn biển
Bacillus velezensis gp-4 MK641661 Bacillus velezensis VMFR14 MZ234617 Bacillus amyloliquefaciens L51 KU551169 Bacillus velezensis NN04 MT114570 Bacillus velezensis G341 MF167634 Bacillus velezensis EBR2 MT916167 Bacillus velezensis B6-2 MT804559 Bacillus velezensis AAB15 MG573218 R4BF4
R8BF10
Sutcliffiella zhanjiangensis JSM 099021 NR 117854 Isoptericola halotolerans NBRC 104116 AB489222 Vibrio harveyi NCIMB1280 NR 043165
Kushneria marisflavi SW32 KCCM 80003 NR 025094 Halomonas flava YIM 94343 NR 109317
Cobetia marina 0402 MH000018 Cobetia marina Alix5 MF474331 R7BF4
Cobetia marina KW30-8-3 JQ670742 Cobetia marina WAB2104 MH169273
60 73 100 59 99 100 100 100
Từ sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng 16S rDNA và cây phát sinh loài (Hình 3.10) đã đưa đến kết quả phân loại 03 chủng vi khuẩn biển thể hiện hoạt tính sinh alginate lyase cao được tuyển chọn thuộc 2 ngành Firmicutes và ngành Proteobacteria. Trong đó, có 2 chủng
B. velezensis R4BF4 và B. velezensis R8BF10 thuộc chi Bacillus, bộ Bacillales, ngành Firmicutes còn chủng Cobetia sp. R7BF4 thuộc chi Cobetia Bacillales, ngành Firmicutes còn chủng Cobetia sp. R7BF4 thuộc chi Cobetia
bộ Oceanospirillales ngành Proteobacteria.
Như vậy, trong nghiên cứu này 03 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và
Cobetia đã được tìm thấy. Kết quả này cũng tương đồng với một số nghiên cứu đã công bố. Cụ thể, Peng Cheng và cộng sự [3] công bố phân lập chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 từ tảo bẹ thối rữa sinh alginate lyase đặc hiệu poly M, Subaryono và cộng sự [92] đã phân Bacillus megaterium S245 được phân lập từ rong biển S. crassifolium sinh alginate lyase đặc hiệu cả poly M và poly G, năm 2016 Wang và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn biển Bacillus litorali từ tảo bẹ Laminaria japonica [93], Nguyễn Thị Thuận và cộng sự [84] đã phân lập được các chủng khuẩn biển sinh alginate lyase thuộc chi Bacillus từ rong biển Việt Nam. Chi Cobetia cũng có nhiều nghiên cứu về phân lập các chủng vi khuẩn sinh biển sinh alginate lyase. Yagi và cộng sự [72] đã công bố chủng vi khuẩn Cobetia sp. NAP1 được phân lập từ các rong nâu Padina arborescens, enzyme sinh alginate của vi khuẩn thuộc họ PL7 có tính ổn định nhiệt độ cao. Cheng và cộng sự [94] đã phân lập chủng vi khuẩn Cobetia sp. cqz5-12 từ rong Sargassum fusiforme.
Trong số 03 chủng vi khuẩn được định danh, trong nghiên cứu này, đề tài đã tiến hành sơ bộ chiết xuất và khảo sát một số đặc tính xúc tác của alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 vì chủng vi khuẩn tạo ra đường kính vòng phân giải alginate cao nhất (35 mm).
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN
3.4.1. Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10. biển B. velezensis R8BF10.
Sau khi lên men lỏng, dịch chiết nội bào và dịch chiết ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus velezensis R8BF10 được kiểm tra bằng phương pháp đĩa thạch alginate, kết quả thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Hoạt tính dịch chiết nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn B. velezensis R8BF10 trên môi trường đĩa thạch alginate chiết từ rong S. mcclurei, đối chứng âm là môi trường MB không chứa vi khuẩn, đối chứng
dương là alginate lyase ngoại bào của chủng B. velezensis AlgSm1 [85] và alginate lyase của Sigma
Kết quả cho thấy, dịch chiết ngoại bào có đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch alginate cao hơn so với dịch chiết nội bào. Kết quả trong nghiên cứu này tương tự với các kết quả nghiên cứu về alginate lyase từ vi khuẩn biển chủ yếu là dịch enzyme ngoại bào như chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas atlantica AR06 [69], Bacillus sp. Alg07 [3].
Dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn B. velezensis R8BF10 được cô đặc qua màng 50 kDa và tủa bằng muối (NH4)2SO4 80%, kết quả thu được như sau (bảng 3.4).