3.3.1. So sánh trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển với các chủng trên ngân hàng gen (NCBI)
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi trên môi trường phân lập MB, sau 24 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc. Khuẩn lạc thuần được nhân sinh khối để tách chiết DNA tổng số và tiến hành PCR nhân bản đoạn 16S rRNA. Sản phẩm PCR sạch với kích thước 1500kb được giải trình tự, phân tích và so sánh với các trình tự các gen có trong ngân hàng GenBank qua công cụ Blast. Kết quả giải trình tự của các chủng vi khuẩn biển được trình bày ở Phụ lục 2.
Kết quả tra cứu so sánh trình tự vùng 16S rDNA của chủng vi khuẩn tuyển chọn tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI bằng công cụ Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Trình tự tương đồng của các chủng vi khuẩn biển
STT
Chủng nghiên
cứu
Trình tự tương đồng (tên chủng) Độ che phủ (%) % tương đồng Mã số Genbank 1 R4BF4 Bacillus velezensis strain NN04 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT114570.1
Bacillus velezensis
strain AAB15 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MG573218.1
Bacillus velezensis
strain G341 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MF167634.1
Bacillus velezensis
strain EBR2 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT916167.1
Bacillus velezensis
strain B6-2 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MT804559.1
2 R7BF4
Cobetia marina strain WAB2104 16S
ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 MH169273.1
Cobetia marina strain 0402 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 MH000018.1
Cobetia marina strain KW30-8-3 16S
ribosomal RNA gen, partial sequence
100 99,86 JQ670742.1
Cobetia marina strain Alix5 16S ribosomal RNA gen, partial sequence (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 R8BF10
Bacillus velezensis
strain gp-4 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MK641661.1
Bacillus velezensis
strain VMFR14 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 MZ234617.1
Bacillus
amyloliquefaciens
strain L51 16S ribosomal RNA gen, partial sequence
100 100 KU551169.1
Từ kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi so sánh chủng vi khuẩn R4BF4 được phân lập từ rong S. oligocystum với 5 chủng: Bacillus velezensis NN04,
B. velezensis AAB15, B. velezensis G341, B. velezensis EBR2, B. velezensis
B6-2, có tỷ lệ tương đồng lên đến 100%. Như vậy, từ sự so sánh trên có thể khẳng định chủng vi khuẩn R4BF4 thuộc chi Bacillus. Từ đó có thể định danh tên loài chủng vi khuẩn biển phân lập được R4BF4 là Bacillus velezensis
R4BF4.
Chủng vi khuẩn R7BF4 được phân lập từ rong B. polycystum có độ tương đồng 99,86% với 3 chủng Cobetia marina WAB2104, C. marina 0402,
C. marina KW30-8-3. Tương đồng 99,78% với 1 chủng C. marina Alix5. Điều đó chúng tỏ chủng vi khuẩn R7BF4 thuộc chi Cobetia. Từ đó có thể định danh tên loài chủng vi khuẩn biển phân lập được R7BF4 là Cobetia sp. R7BF4.
Đối với chủng vi khuẩn biển R8BF10 được phân lập từ rong Turbinaria ornata thì so sánh với 5 chủng: B. velezensis gp-4 16S, B. velezensis
VMFR14 16S, B. amyloliquefaciens L51 có tỷ lệ tương đồng 100%. Như vậy, chủng vi khuẩn biển R8BF10 thuộc chi Bacillus. Tên định danh của chủng vi khuẩn biển phân lập được R8BF10 là Bacillus velezensis R8BF10.
Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của 03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI được trình bày ở phụ lục 2.
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài.
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen vùng 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển theo phương pháp Neighbor Joining bằng phần mềm MEGA 11 với vòng lập 1000 lần. Giá trị Bootstrap value được biểu hiện trên các nhánh.
Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA của các
chủng vi khuẩn biển
Bacillus velezensis gp-4 MK641661 Bacillus velezensis VMFR14 MZ234617 Bacillus amyloliquefaciens L51 KU551169 Bacillus velezensis NN04 MT114570 Bacillus velezensis G341 MF167634 Bacillus velezensis EBR2 MT916167 Bacillus velezensis B6-2 MT804559 Bacillus velezensis AAB15 MG573218 R4BF4
R8BF10
Sutcliffiella zhanjiangensis JSM 099021 NR 117854 Isoptericola halotolerans NBRC 104116 AB489222 Vibrio harveyi NCIMB1280 NR 043165
Kushneria marisflavi SW32 KCCM 80003 NR 025094 Halomonas flava YIM 94343 NR 109317
Cobetia marina 0402 MH000018 Cobetia marina Alix5 MF474331 R7BF4
Cobetia marina KW30-8-3 JQ670742 Cobetia marina WAB2104 MH169273 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
60 73 100 59 99 100 100 100
Từ sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng 16S rDNA và cây phát sinh loài (Hình 3.10) đã đưa đến kết quả phân loại 03 chủng vi khuẩn biển thể hiện hoạt tính sinh alginate lyase cao được tuyển chọn thuộc 2 ngành Firmicutes và ngành Proteobacteria. Trong đó, có 2 chủng
B. velezensis R4BF4 và B. velezensis R8BF10 thuộc chi Bacillus, bộ Bacillales, ngành Firmicutes còn chủng Cobetia sp. R7BF4 thuộc chi Cobetia Bacillales, ngành Firmicutes còn chủng Cobetia sp. R7BF4 thuộc chi Cobetia
bộ Oceanospirillales ngành Proteobacteria.
Như vậy, trong nghiên cứu này 03 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và
Cobetia đã được tìm thấy. Kết quả này cũng tương đồng với một số nghiên cứu đã công bố. Cụ thể, Peng Cheng và cộng sự [3] công bố phân lập chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 từ tảo bẹ thối rữa sinh alginate lyase đặc hiệu poly M, Subaryono và cộng sự [92] đã phân Bacillus megaterium S245 được phân lập từ rong biển S. crassifolium sinh alginate lyase đặc hiệu cả poly M và poly G, năm 2016 Wang và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn biển Bacillus litorali từ tảo bẹ Laminaria japonica [93], Nguyễn Thị Thuận và cộng sự [84] đã phân lập được các chủng khuẩn biển sinh alginate lyase thuộc chi Bacillus từ rong biển Việt Nam. Chi Cobetia cũng có nhiều nghiên cứu về phân lập các chủng vi khuẩn sinh biển sinh alginate lyase. Yagi và cộng sự [72] đã công bố chủng vi khuẩn Cobetia sp. NAP1 được phân lập từ các rong nâu Padina arborescens, enzyme sinh alginate của vi khuẩn thuộc họ PL7 có tính ổn định nhiệt độ cao. Cheng và cộng sự [94] đã phân lập chủng vi khuẩn Cobetia sp. cqz5-12 từ rong Sargassum fusiforme.
Trong số 03 chủng vi khuẩn được định danh, trong nghiên cứu này, đề tài đã tiến hành sơ bộ chiết xuất và khảo sát một số đặc tính xúc tác của alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 vì chủng vi khuẩn tạo ra đường kính vòng phân giải alginate cao nhất (35 mm).
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN
3.4.1. Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10. biển B. velezensis R8BF10.
Sau khi lên men lỏng, dịch chiết nội bào và dịch chiết ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus velezensis R8BF10 được kiểm tra bằng phương pháp đĩa thạch alginate, kết quả thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Hoạt tính dịch chiết nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn B. velezensis R8BF10 trên môi trường đĩa thạch alginate chiết từ rong S. mcclurei, đối chứng âm là môi trường MB không chứa vi khuẩn, đối chứng
dương là alginate lyase ngoại bào của chủng B. velezensis AlgSm1 [85] và alginate lyase của Sigma
Kết quả cho thấy, dịch chiết ngoại bào có đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch alginate cao hơn so với dịch chiết nội bào. Kết quả trong nghiên cứu này tương tự với các kết quả nghiên cứu về alginate lyase từ vi khuẩn biển chủ yếu là dịch enzyme ngoại bào như chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas atlantica AR06 [69], Bacillus sp. Alg07 [3].
Dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn B. velezensis R8BF10 được cô đặc qua màng 50 kDa và tủa bằng muối (NH4)2SO4 80%, kết quả thu được như sau (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả sơ bộ thu nhận alginate lyase
Các bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu nhận enzyme (%) Độ sạch enzyme (Lần) Dịch ngoại bào 112,00 23,59 0,21 100,00 1,00 Màng 50kDa 97,00 40,80 0,42 86,61 2,00 (NH4)2SO4 80% 49,00 50,96 1,04 43,75 4,94
Kết quả bước đầu thu nhận alginate lyase ngoại bào từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 cho thấy dịch ngoại bào có hoạt tính 23,59 U/ml. Dịch chiết ngoại bào đã được thực hiện qua hai bước để bước đầu thu nhận enzyme là sử dụng màng cô đặc 50kDa và tủa bằng muối (NH4)2SO4 80%. Sau giai đoạn tinh sạch ban đầu, hoạt tính enzyme tăng 4,96 lần và hiệu suất thu nhận protein đạt 43,75%. Enzyme này được sử dụng để bước đầu đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường phản ứng đến hoạt tính enzyme. Enzyme này được đặt tên là BalyA.
3.4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA
Để đánh giả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA, hỗn hợp phản ứng được ủ ở khoảng nhiệt độ từ 25 đến 55ºC. Hoạt tính enzyme được ghi nhận và thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA
Kết quả cho thấy enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 40oC. Trong khoảng nhiệt độ từ 30-35oC, enzyme thể hiện hoạt tính từ 56,8% đến 85,5% so với điểm nhiệt độ tối ưu. Khi tăng nhiệt độ lên 45oC hoạt tính enzyme con 78,5% và chỉ còn 15,5% khi tăng nhiệt độ lên 55oC. Kết quả về nhiệt độ hoạt động tối ưu trong nghiên cứu này tương tự với alginate lyase AlgA từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. Alg07 [3] và Vibrio sp. QY 105 [73], Serratia marcescens NJ – 07 [74], Isoptericola halotolerans NJ-05 [75]
3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA
Để khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA, khoảng pH từ 5-8 đã được đã được tiến hành, kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính BalyA được thể hiện ở Hình 3.13.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Hoạ t tính (% ) Nhiệt độ oC
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA
Kết quả cho thấy enzyme hoạt động tốt nhất ở pH 7,0 và duy trì hoạt tính 85% ở pH 8, tại điểm pH 8,5 hoạt tính của lyase chỉ còn 59%. Như vậy BalyA hoạt động trong môi trường từ trung tính đến kiềm yếu. Kết quả này của chúng tôi thu nhận được khá tương đồng với các chủng vi khuẩn biển, hầu như có pH hoạt động ở vùng trung tính hoặc kiềm yếu, trong khi đó, pH hoạt động của alginate lyase từ động vật biển có pH hoạt động ở vùng acid yếu. Với khoảng hoạt động từ pH 6-8 (Hoạt tính thấp nhất là 72%), BalyA có tiềm năng để ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, cần nghiên cứu sâu hơn về độ bền pH vì ở quy mô lớn, phản ứng thủy phân xảy ra, pH khó duy trì ổn định.
3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA
Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại được thể hiện ở Hình 3.14. Kết quả cho thấy các ion kim loại hoạt hóa enzyme gồm Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+; các ion kim loại ức chế hoạt tính enzyme là Zn2+. Trong đó các ion Ca2+, Mg2+ có khả năng hoạt hóa enzyme mạnh nhất. Kết quả này tương tự với kết quả alginate lyase thu nhận từ các chủng vi khuẩn biển như
Bacillus sp. Alg07 [3] và Vibrio sp. QY 105 [73]. 0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính (% ) pH
Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của BalyA
Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl được thể hiện ở Hình 3.15. Kết quả cho thấy enzyme hoạt động mạnh nhất ở nồng độ NaCl 250 mM. So với kết quả alginate lyase thu nhận từ các chủng vi khuẩn biển như Bacillus sp. Alg07 nồng độ muối NaCl 200 mM [3] và Vibrio sp. QY 105 NaCl 200 mM [74] thì enzyme thu được từ chủng vi khuẩn biển Bacillus
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Đối chứng Ca2+ Mg2+ Mn2+ Co2+ Ni2+ Zn2+
Hoạt
tính (%
)
Các inon hóa trị II
0 20 40 60 80 100 120 -100 0 100 200 300 400 500 600 Hoạt tính (% ) Nồng độ NaCl (mM) Ca2+ Mg2+ Mn2+ Co2+ Ni2+ Zn2+
velezensis R8BF10 hoạt động mạnh nhất ở nồng muối NaCl cao hơn lên đến 250 mM.
3.4.6. Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu nhận được
Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu được trên cơ chất alginate chiết từ rong S. mcclurei và T. ornata được thể hiện ở hình 3.16. Kết quả cho thấy alginate lyase cắt alginate thành các đoạn có KLPT nhỏ tạo thành các band với kích thước khác nhau trên C-PAGE.
Hình 3.16. Kết quả điện di C- PAGE của alginate chiết từ rong
S. mcclurei, T. ornata và phản ứng giữa alginate và alginate lyase sau 24h phản ứng. (1) S. mcc A, (2) T. o A, (3) T. oA + BalyA, (4) S. mccA + BalyA
Kết quả thu nhận được ở Hình 3.16 cho thấy, khi BalyA phản ứng cắt mạch alginate chiết từ hai loài rong S. mcclurei và T.ornata là khác nhau. Hoạt tính của BalyA trên cơ chất S. mcc A mạnh hơn, tạo thành các band rõ ràng. Điều này có thể giải thích được rằng, chủng vi khuẩn tuyển chọn được phân lập trên môi trường chứa cơ chất đặc hiệu là S. mcc A nên có tính đặc tính xúc tác phù hợp với alginate từ rong S. mcclurei hơn là rong T.ornata. Tuy nhiên, nhận định này cần được xác nhận lại bằng nghiên cứu sâu hơn về tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được 47 chủng vi khuẩn biển từ 05 mẫu rong thu được từ vùng biển Khánh Hòa với đặc điểm khuẩn lạc khá đa dạng. Kết quả này đã bổ sung thêm vào bộ sưu tập vi sinh vật biển của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang những chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong nâu, tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu khác về sinh vi khuẩn biển.
2. Trong số 47 chủng vi khuẩn biển đã sàng lọc và tuyển chọn được 25 chủng có hoạt tính sinh alginate lyase. Trong đó, có 9 chủng có đường kính vòng phân giải trên 30 mm. Từ đó, đã lựa chọn 3 chủng vi khuẩn để định danh là các chủng R4BF4 được phân lập từ rong S. oligocystum; chủng vi khuẩn R7BF4 được phân lập từ rong S. polycystum; chủng vi khuẩn R8BF10 được phân lập từ rong T. ornata. Kết quả đã cung cấp cơ sở dữ liệu những chủng vi khuẩn tiềm năng sinh alginate lyase, phục vụ cho việc nghiên cứu các enzyme tiềm năng từ vi khuẩn biển.
3. Ba (03) chủng vi khuẩn tuyển chọn được phân loại dựa trên phân tích trình tự gen vùng 16s rDNA bao gồm: B. velezensis R4BF4, Cobetia sp. R7BF4, B. velezensis R8BF10.
4. Alginate lyase từ chủng B. velezensis R8BF10 (BalyA) đã được thu nhận enzyme sơ bộ và thể hiện hoạt tính tốt nhất ở 40oC, pH 7, 10 mM Ca2+ và nồng độ 250 mM NaCl. BalyA có khả năng chuyển hóa alginate chiết từ rong S. mcclurei thành các sản phẩm có KLPT thấp.
Như vậy với các kết quả thu được qua các nội dung nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra đó là tìm được 25 chủng vi khuẩn biển, định danh được 03 chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có khả năng sinh alginate lyase; alginate lyase thu từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 có khả năng chuyển hóa alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam là S. mcclurei và
4.2. KIẾN NGHỊ
Trong tổng số 47 chủng vi khuẩn phân lập được, chỉ mới hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn được ghi nhận. Để có một cơ sở dữ liệu đầy đủ hơn về bộ sưu tập vi sinh vật biển, đề tài xin được kiến nghị bổ sung thêm đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn này bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Đồng thời có thể định danh tiếp các chủng vi khuẩn biển tiềm năng trong tổng số 25 chủng vi khuẩn biển có hoạt tính.
Việc nghiên cứu tinh sạch enzyme chỉ mới thực hiện ở hai bước là cô đặc và tủa bằng muối ammonium sulfate. Đề tài kiến nghị nghiên cứu sâu hơn việc tinh sạch enzyme qua các bước sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel để thu enzyme có độ tinh khiết cao và hoạt tính mạnh.
Việc xác định đặc tính của enzyme mới chỉ được thực hiện ở bước cơ