CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2.1.Định nghĩa về alginate lyase
1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE
1.2.1.Định nghĩa về alginate lyase
Alginate lyase là một nhóm các enzyme xúc tác quá trình khử alginate thành oligosaccharide. Alginate lyase xúc tác quá trình khử β phá vỡ các liên kết glycoside giữa các monome và tạo ra liên kết đôi tại C4 và C5 của các vòng đường cacbon, trong quá trình đó liên kết 4 – O – glycoside sẽ bị loại bỏ và tạo thành các oligosaccharide [4], [31], [45]. Alginate lyase đã được ứng dụng trong quá trình sản xuất oligosaccharide và phân tích cấu trúc polysaccharide.
Alginate lyase có KLPT dao động từ 24 kDa -110 kDa, là đồng trùng hợp của α-L-guluronate (G) và C5 epimer β D-mannuronate (M) của nó, được sắp xếp như các khối G homopolymer, khối M, xen kẽ GM hoặc dị trùng hợp ngẫu nhiên G / M kéo dài.
1.2.2. Phân loại alginate lyase
Alginate lyase gồm nhiều loại khác nhau được thu nhận từ các nguồn vi sinh vật, virus, nấm,… nên có nhiều cách phân loại:
Dựa vào đặc hiệu cơ chất, alginate lyase được chia làm 3 loại với tính đặc hiệu với G-block (EC4.2.2.11), đặc hiệu với M-block (EC4.2.2.3) và một nhóm enzyme đặc hiệu với poly M và cả poly G là MG-block (EC4.2.2.-) [4].
Dựa vào cơ chế hoạt động, alginate lyase được chia làm 2 nhóm là alginate lyase endolytic và alginate lyase exolytic. Alginate lyase endolytic tách các liên kết glycoside bên trong phân tử alginate và giải phóng các oligoalginate, đó có thể là các disacharide, trisacharide, tetrasacharide… Trong khi alginate lyase exolytic có thể tách nhỏ phân tử alginate và các đoạn oligoalginate thành các monosacharide [4].
Dựa vào cấu trúc sơ cấp của enzyme, alginate lyase chia vào 7 họ của polysaccharide lyase là 5, 6, 7, 14, 15, 17 và 18. Hầu hết, exolytic alginate
lyases nằm trong họ polysaccharide lyase số 15 và 17. Phần lớn alginate lyase thu nhận từ vi khuẩn được chia vào các họ polysaccharide lyase số 5, 7, 15 và 17. Alginate lyase thu từ động vật thân mềm và virus thuộc họ polysaccharide lyase số 14. Alginate lyase đa chức là enzyme có khả năng cắt liên kết G-M block được chia riêng vào họ polysaccharide lyase số 18 [4], [44], [46]. Theo Cheng và công sự [47] ngoài 7 họ alginate lyase trên thì còn chia vào thêm 5 họ polysaccharide lyase gồm 31, 32, 34, 36 và 39.
Ngoài ra, alginate lyase còn được phân loại theo KLPT: nhỏ (25- 30kDa), trung bình (khoảng 40kDa) và lớn (hơn 60kDa) như: alginate lyase từ vi khuẩn biển Pseudomonas alginovora có trọng lượng 28 kDa,
Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5 trọng lượng 40.04 kDa, Alginovibrio aquatilis trọng lượng 110 kDa [4].
1.2.3. Nguồn thu nhận alginate lyase
Alginate lyase khác nhau được thu nhận từ nhiều nguồn bao gồm: Vi khuẩn biển, động vật thân mềm biển, vi nấm biển, vi khuẩn trên cạn, nấm và virus. Một số chủng vi khuẩn có thể kể đến: gram dương là Bacillus circulans
và gram âm là Azotobacter vinelandii, Klebsiella aerogens, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida, and
Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn này có khả năng sản xuất alginate lyase [5].
Shiraiwa và cộng sự [48] đã nghiên cứu về nguồn thu nhận alginate lyase từ tảo biển của một số loại: Spatoglossum pacificum, Colpomenia sinuosa, Endarachne binghamiae, Undaria pinnatifida, Sargassum sagamianun, Ishige spp.,. Ông nhận thấy rằng hoạt tính của alginate lyase thu từ tảo thay đổi theo mùa và nhiều alginate lyase từ tảo biển đặc hiệu cả poly M và poly G [48]. Alginate lyase thu nhận từ gan, tụy của các động vật thân mềm như bào ngư, ốc bàn tay, … thì thường là enzyme endolytic, đặc hiệu với poly M [6]. Vi khuẩn đất gram âm và gram dương cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều như Azotobacter vinelandii, A. chrococcum đã được giải trình tự nhận dạng acid amin [6].
Vi khuẩn biển là nguồn thu nhận alginate lyase được nghiên cứu nhiều nhất như Alteromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio harveyi, Vibrio sp.,. Các chủng vi khuẩn biển đều có liên quan đến tảo biển hoăc các động vật thân mềm như cầu gai, hải sâm,… vì chúng sử dụng nguồn alginate làm nguồn cacbon chính. Chính vì vậy, vi khuẩn biển là nguồn tiềm năng nhất để thu nhận alginate lyase.
1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase
Alginate lyase có nguồn gốc từ vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp, y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học. Do đó, các nhóm vi sinh vật khác nhau cần được sàng lọc để chọn được đối tượng tiềm năng sản xuất alginate lyase. Đề giải quyết vấn đề này, đã có những phương pháp sàng lọc định tính rất tốt nhằm xác định khả năng sản xuất alginate lyase của vi sinh vật.
1.2.4.1. Phương pháp đĩa thạch
Phương pháp đĩa thạch alginate là một trong những phương pháp phổ biến. Lợi ích của phương pháp này là thân thiện, đơn giản, dễ thực hiện, có thể sử dụng để sàng lọc lượng lớn vi sinh vật và tiết kiệm thời gian.
Nguyên tắc của phương pháp đĩa thạch có chứa alginate: là nuôi cấy vi sinh vật lên đĩa thạch có chứa cơ chất là alginate. Vi sinh vật nếu sản sinh alginate lyase, enzyme này sẽ bẻ ngắn mạch alginate tạo các sản phẩm có KLPT thấp, sản phẩm này không bị bắt màu bởi các loại thuốc thử đặc trưng, tạo ra vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Vùng bị nhuộm màu là alginate KLPT cao. Có nhiều loài thuốc thử khác nhau để phát hiện sàng lọc alginate lyase từ vi sinh vật được các nhà khoa học sử dụng và công bố.
Năm 1990, Peter Gacesa đã sử dụng 0,1% polyguluronate và polymannuronate từ alginate để làm cơ chất trong môi trường đĩa thạch, sau đó cho vi khuẩn phát triển trên đĩa môi trường. Chủng vi khuẩn được cho là có khả năng sinh alginate lyase là chủng mà tạo ra được vòng phân giải trên đĩa thạch sau khi nhuộm với cetyl pyridinium clorua (CPC) hoặc đỏ
ruthenium [49]. Takeshita và cộng sự [50] đã phát triển một phương pháp cải tiến dựa trên việc sử dụng song song thuốc thử phổ biến hơn đó là canxi clorua cùng với 70% etanol nhằm kết tủa alginate không bị phân giải bởi enzyme trong môi trường thạch đĩa. Baron và cộng sự [51] đã sử dụng 1,5% agarose và 1% natri alginate giàu G chiết xuất từ loài từ loài rong Laminaria hyperborea nhằm xác định tính đặc hiệu của alginate lyase đối với poly G từ loài vi khuẩn Klebsiella pneumoniae được biểu hiện trên Escherichia coli. Với việc sử dụng các thuốc thử nêu trên khó quan sát bằng mắt thường. Đến năm 2015, Sawant và cộng sự đã phát triển phương pháp này bằng cách sử dụng thuốc thử Gram’s iodine. Gram’s iodine tạo thành phức màu đen hơi xanh với alginate KLPT cao nhưng không tạo phức với alginate bị thủy phân, tạo ra các vùng sắc nét, rõ ràng xung quanh các khuẩn lạc vi sinh vật chỉ trong vòng 2-3 phút nhuộm. Phương pháp sử dụng Gram’s iodine được phát hiện có hiệu quả hơn phương pháp sử dụng CPC làm thuốc thử về hình ảnh và dễ dàng đo kích thước vùng phân giải [52].
1.2.4.2. Phương pháp đo độ đục
Là một phương pháp so màu đơn giản để xác định hoạt động của alginate lyase dựa trên sản phẩm là các axit uronic không bão hòa được tạo ra bởi tác dụng của alginate lyase. Các sản phẩm tạo phức với axit thiobarbituric được phát hiện bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 548 nm. Đơn vị enzyme được biểu thị dưới dạng micromol ß-formyl pyruvate tạo ra trong một phút đối với một ml enzyme.Phương pháp này nhạy và đặc hiệu, và nó ít bị nhiễu bởi các hợp chất thường có trong dịch chiết thô. Tuy nhiên, đường không bão hòa có thể có trong một số môi trường nuôi cấy như muối amoni sulfate hoặc sucrose có thể làm gia tăng độ hấp thụ, do đó, khi sử dụng phương pháp này cần loại bỏ các đường này bằng thẩm tách [53].
1.2.4.3. phương pháp đo độ nhớt
Dung dịch alginate ở nồng độ thích hợp cho thấy độ nhớt đáng kể, độ nhớt này bị giảm do sự phân hủy alginate. Do đó, độ nhớt là một chỉ số đánh giá hoạt động của alginate lyase. Có thể làm rõ phương thức hoạt động của alginate lyase bằng cách theo dõi và vẽ biểu đồ độ nhớt tương đối (ηr) theo
thời gian. Khi alginate bị phân hủy theo cách nội phân, độ nhớt bị giảm nhanh chóng ở giai đoạn đầu của phản ứng. Phương pháp này cần phải có lượng lớn alginate và enzyme, cũng như cần có máy đo chuyên dụng để kiểm soát nhiệt độ của alginate.
1.2.3.4. Phương pháp đường khử
Phương pháp đường khử hay gọi là phương pháp Nelson – Somogyi [40] dung để định lượng hoạt tính. Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Sản phẩm tạo thành bởi sự xúc tác của alginate lyase có chứa đầu khử và đầu không khử có nối đôi, do đó, các nghiên cứu về alginate lyase cũng thường sử dụng phương pháp đo đường khử trong sản phẩm phản ứng để định lượng hoạt tính. Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol đường khử trong 1 phút. Phương pháp thường sử dụng là 3,5- dinitrosalicylic acid (DNS).
Phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 0,1 ml enzyme đã chuẩn bị vào 0,9 ml natri alginate 1% hòa tan trong 50 mM dung dịch đệm sodium phosphate (ở pH 7,5). Sau khi ủ ở 40oC trong 20 phút, phản ứng dừng lại bằng thêm 0,5ml thuốc thử DNS và đun nóng ở 100oC trong 5 phút. Sau khi làm mát đến nhiệt độ phòng, hoạt động được đo bằng cách theo dõi độ hấp thụ tăng lên của các sản phẩm phản ứng (giảm đường) ở bước sóng 540 nm. Một đơn vị hoạt động của alginate lyase (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để tạo ra 1mg đường khử (tương đương glucose) mỗi phút [40]. Ngoài ra còn sử dụng phương pháp Nelson – Somogyi dựa trên độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm của một hợp chất màu được hình thành giữa đường oxy hóa đồng và arsenomolybdate [54]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.2.3.5. Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng
Hoạt tính alginate lyase còn được tính bằng phương pháp đo quang phổ trực tiếp các sản phẩm axit uronic không bão hòa được tạo ra bởi alginate lyase trên cơ chất alginate [53]. Phương pháp này để xác định hiệu của uronic, phản ứng alginate lyase trên alginate dẫn đến sự hình thành liên kết đôi giữa C4 và C5 ở đầu không tạo ra sản phẩm phân hủy và hỗn hợp phản ứng cho
thấy đỉnh hấp thụ ở 235 nm. Do đó, sự gia tăng độ hấp thụ ở bước sóng 235 nm là một chỉ số của hoạt tính alginate lyase.
1.3. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN
1.3.1. Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase
Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được phân lập từ cầu gai, san hô mềm, rong biển và những loài động vật hai mảnh. Sở dĩ được tìm kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những loài sử dụng rong tảo làm thức ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những loài này luôn có một hoặc một hệ vi khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn. Ngoài ra, nước biển và hải miên cũng là nguồn để phân lập vi sinh vật sản sinh alginate lyase [6]. Các chủng vi khuẩn phổ biến sinh alginate lyase như:
Sphingomonas sp., Flavobacterium sp., Saccharophagus sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp.,….(được trình bày ở Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase
STT Vi khuẩn biển Nguồn phân lập
Nguồn tài liệu tham
khảo
1 Alginovibrio aquatilis Từ nước biển, đất [59] 2
Alteromonas sp. (chủng H-4) Từ phân hủy tảo biển Lamina
japonia, [60] [61] 3 Tamlanap sp. Hải sâm Apostichopus japonicus [62] 4 Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5 Từ đất ngập mặn [63] 5 Vibrio furnissii H1 Rong biển thối rửa [64] 6 Pseudomonas alginovora Tảo nâu Laminaria [56], [65]
7 Vibrio sp. Tảo nâu [66]
8 Vibrio harveyi AL-128 Nước biển [67]
Đáng chú ý năm 1976 I. W. Davidson và cộng sự thuộc trường đại học Edinburgh, vương quốc Anh đã tiến hành nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển thuộc họ Pseudomonadaceae. Đây là enzyme ngoại bào thuộc
EC4.2.2.3 đã mở ra hướng nghiên cứu mới các chủng vi khuẩn biển được phân lập từ rong biển sống trong môi trường giàu alginate [55].
Mỗi chủng vi khuẩn thường sinh mỗi loại enzyme và đa số là enzyme Endolytic. Tuy nhiên, cũng có nhiều chủng vi khuẩn tạo ra nhiều hơn một enzyme như Pseudomonas alginovora có cả enzyme poly G và poly M [56]. Doubets và cộng sự [58] đã công bố alginate lyases (EC 4.2.2.3) thu từ 2 loài vi khuẩn biển A3, W3 được phân lập từ rong nâu Fucus. Trong đó, chủng vi khuẩn biển A3 sinh alginate lyase ngoại bào đặc hiệu Poly M và W3 sinh alginate lyase nôi bào đặc hiệu poly G [58].
Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp. Môi trường dinh dưỡng để nuôi vi khuẩn rẻ tiền, dễ kiếm. Nên enzyme thu từ việc nuôi vi khuẩn sẽ nhanh hơn, rẻ hơn giúp tăng lợi nhuận. Bên cạnh đó, việc tìm kiếm alginate lyase mới từ vi khuẩn giúp dễ dàng hơn trong việc xác định gen mã hóa enzyme do bộ gen của vi khuẩn biển nhỏ hơn sơ với các sinh vật khác như vi nấm hay động vật biển, dẫn đến dễ dàng hơn trong việc nghiên cứu enzyme tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong quy mô công nghiệp [68].
Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng các alginate lyase có khả năng kém trong ổn định nhiệt độ, hiệu suất xúc tác thấp để sản xuất AOS ở quy mô công nghiệp. Vì vậy, hiện nay các nhà khoa học tập trung vào tìm kiếm các alginate lyase từ vi khuẩn biển có hiệu suất cao, hoạt tính cao ứng dụng tiềm năng trong sản xuất alginate oligosaccharide như chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 [3].
1.3.2. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển
Hầu hết alginate lyase được công bố từ vi khuẩn biển là enzyme ngoại bào như Pseudoalteromonas atlantica AR06 [69], Bacillus sp. TAG8 [5]. Điều này có thể được giải thích là do alginate là hợp chất đại phân tử, khó có thể hấp thu qua thành tế bào vi khuẩn. Do đó, các chủng vi khuẩn biển cần phải tiết ra môi trường enzyme chuyển hóa alginate thành alginate oligosaccharide để dễ dàng sử dụng cho hoạt động sống của chúng. Tuy
nhiên, một số vi khuẩn biển cũng được tìm thấy có sản xuất alginate lyase nội bào như Alteromonas sp. [61]. Điều này chứng tỏ, vi sinh vật biển có những cơ chế đặc biệt để có thể sử dụng các chất dinh dưỡng ở môi trường nhằm mục đích cung cấp nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Vì vậy, khi tìm kiếm, nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển cần phải tiến hành kiểm tra dịch chiết nội bào và ngoại bào để xác định đúng vị trí sản xuất của alginate lyase. Nhiều yếu tố, chẳng hạn như nguồn cacbon, nguồn nitơ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất alginate lyase. Tuy nhiên, chỉ có một vài báo cáo liên quan đến tối ưu hóa quá trình lên men, điều kiện nuôi cấy và vi sinh vật sản xuất alginate lyase [70], [71]. Hầu hết các công bố liên quan đến alginate lyase từ vi khuẩn biển đều sử dụng môi trường biển có bổ sung alginate là nguồn carbon cảm ứng vi khuẩn sinh enzyme [3], [70], [72], [73]. Do đó, khi nghiên cứu vi sinh vật sinh alginate lyase thì cần nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển
STT Vi khuẩn biển Đặc hiệu
enzyme Khối lượng phân tử (kDa) pH Nhiệt độ (toC) Đặc tính xúc tác, ảnh hưởng của các
ion kim loại
Nguồn tài liệu tham khảo
1 Vibrio furnissii H1 Poly M/ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
poly G 35,8 7,5 30
NaCl 0.3M, Zn2+, Fe2+, Cu2+,
Mn2+, Ag+
[64]
2 Bacillus sp. Alg07 Poly M 60 7,5 40 NaCl 0.2 M, Mg2+, Ca2+ [3] 3 Serratia marcescens NJ – 07 Poly M 25 9 40 NaCl từ 0.1- 0.3M, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Na+ [74] 4 Isoptericola halotolerans NJ-05 Poly M/ poly G 25,32 7 40 NaCl 0.1- 0.3M, Na+, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [75]
5 Flavobacterium sp. UMI-01 PolyM 30 7,5 55 NaCl 100 mM, MgCl2 , CoCl2, NiCl2 5mM [76] 6 Pseudoalteromonas sp. SM0524 Poly M/ poly G 32 8,5 50 NaCl 0.2M, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Co2+ Ba2 +, Ni2+ và Sr2. [7] 7 Enterobacter cloacae M-1 poly G 32 7,8 30 , EDTA, CaCl2, AlCl3, MnCl2, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [78]
8 Vibrio harveyi AL-
128 poly G 57 7,8 NaCl từ 0,3-1M Zn2+, Hg2+, Ag +, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+ [66] 9 Alteromonas portus HB161718T Poly G 60 8 25