1.3.1 .Tổng quan về mây
1.3.3. Tổng quan về mây nếp
1.3.3.1. Đặc điểm sinh thái, hình thái lồi mây nếp
Giống mây nếp (C. tetradactylus Hance) là giống mây cao sản của Việt Nam, phân bố tập trung tại các tỉnh phía Bắc: Lào Cai, n Bái, Hồ Bình, Thanh Hố. Có đặc điểm sinh học: Thân ngầm củ gừng, vở màu đen; Thân khí sinh mọc thành cụm, dài 10 - 20m, đường kính từ 0,8 - 1,2cm; Lá đơn xẻ thuỳ lơng chim rất sâu. Khi cây cịn nhỏ, lá có cuống dài, trên đỉnh mang 4-6 thuỳ, thuỳ dài 10 - 18cm, rộng 1,5 - 2cm. Khi cây lớn, lá dài 1m, mang 14 - 20 thuỳ, mọc thành từng khóm 2 - 4 thuỳ cách nhau 4 - 15cm, thuỳ lá hình mác thn hay mác ngược, dài 10 - 30cm, rộng 2 - 4cm, thót ở hai đầu, mép lá có gai nhỏ, đỉnh có chùm lơng màu tím. Hoa bơng mo dài, mảnh, từ trục chính mọc ra 4 - 5 chuỳ, chuỳ phân nhánh thành các bông chét, mỗi bông chét mang 8 - 24 hoa. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa là một dạng bơng mo đặc biệt, xuất hiện trên các tay mây trên ngọn. Hoa đực nhỏ, đài 3, tràng 3, nhị 6. Hoa cái nhỏ, có cuống nhỏ. Quả hạch hình cầu, đường kính 8mm, đầu có mỏ nhọn và núm nhuỵ tồn tại, vỏ có vẩy bao bọc, xếp thành 18 hàng dọc, mỗi quả một hạt đường kính 6mm. Mỗi cây mang 4 - 5 buồng quả, khoảng 1.000 quả/buồng. Giống mây nếp có giá trị
kinh tế cao do có năng suất cao và nguyên liệu đảm bảo chất lượng sản xuất sản phẩm xuất khẩu. Hiện nay giống mây nếp đang được trồng rừng nguyên liệu tại nhiều vùng miền trên cả nước [10].
1.3.3.2. Các nghiên cứu về mây nếp trên thế giới
Đã có nhiều tác giả nghiên cứu về loài cây này ở Trung Quốc. Kết quả nghiên cứu của Xu Huangcan và cộng sự (2000) [38] cho thấy Mây nếp là lồi cây mọc thành cụm, thân tương đối dài, có hoa đơn tính khác gốc, thân có thể dài khoảng 30 m hoặc hơn, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Trung Quốc. Mây nếp là lồi đang được trồng nhiều ở phía Nam Trung Quốc, đảo Hải Nam, một phần ở phía Nam tỉnh Quảng Đơng từ 22o30’ vĩ độ Bắc và cả ở Hồng Kơng với tổng diện tích có lồi cây này lên đến 200.000 km2.
Là loài cây ưa ẩm nhưng cũng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên độ cao thấp hơn 700 m so với mực nước biển trong điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới gió mùa. Mặc dù có thể phát hiện thấy Mây nếp tại những vùng đất trũng ẩm ướt và lưu vực nhưng lồi này khơng chịu được ngập úng. Mây nếp sinh trưởng nhanh, nảy chồi tốt trong suốt mùa mưa khi mà lượng mưa dồi dào, độ ẩm khơng khí tương đối cao và ngược lại với mùa khô, Mây nếp cũng sinh trưởng và phát triển tốt ở những nơi đất dốc và độ pH H2O thích hợp là 5,0 - 6,4 . Kết quả nghiên cứu trong 6 năm, Xu Huangcan và cộng sự (2000) cho thấy Mây nếp phát triển rất chậm trong thời gian từ tuổi 1 đến 3, sinh trưởng hàng năm dưới 0,3 m và sau 3 năm chiều cao thân dưới 0,5 m. Sinh trưởng chiều cao thân hàng năm vượt quá 1,0 m khi cây trồng sau 4 năm.
Việc nhân giống thường dùng bằng hạt nhưng cũng có thể sử dụng phương pháp tách chồi. Hạt được gieo ươm trong nền đất cát 50 - 70 ngày, sau khi nảy mầm đem cấy vào bầu và chăm sóc trong vườn ươm từ 15 - 18 tháng, khi cây có từ 7 - 9 lá có thể mang đi trồng. Sau khi trồng 6 - 7 năm có thể thu hoạch với sản lượng đạt 1 - 2 tấn/ha. Lần khai thác thứ 2 vào năm thứ 11 với
sản lượng 1 - 1,5 tấn/ha. Nếu trên 25 năm, sản lượng có thể lên đến 6 tấn/ha (Xu Huangcan và cộng sự, 2000) [39].
Nhiều nghiên cứu tại Ấn Độ cho thấy đối với Mây nếp phương pháp xử lý hạt tốt nhất là xông bằng hương muỗi (J.K.Rawat, 2001) [29].
Giống như nhiều loài song mây sinh trưởng thành dạng bụi khác, Mây nếp cũng có thể nhân giống bằng các chồi mầm, nhưng biện pháp nhân giống bằng hạt vẫn phổ biến hơn cả. Hạt cần được tách và làm sạch ngay sau khi thu hái quả chín nhằm nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt. Có thể làm sạch vỏ quả và áo hạt bằng cách chà xát với cát hoặc ngâm trong nước. Hạt đã làm sạch cần giữ độ ẩm từ 25 - 30%. Tỷ lệ nảy mầm của hạt tươi từ quả chín có thể đạt tới 98%. Thực tế ở Trung Quốc cho thấy rằng hạt trước tiên được ngâm và đãi sạch trong nước trong vòng 1 - 3 ngày, sau đó gieo trên các luống cát có che nắng và sau 50 - 70 ngày khi các cây con với lá đầu tiên xuất hiện có thể đem cấy vào các bầu đất và hỗn hợp phân bón. Các bầu cây được đặt cạnh nhau trong vườn ươm với cường độ ánh sáng tối thích với mây con khi được che sáng 50% (Xu Huangcan và cộng sự, 2000) [39].
1.3.3.3. Những nghiên cứu về mây nếp ở Việt Nam
Hiện nay, Mây nếp là một trong những loài được lựa chọn ưu tiên cho các chương trình trồng rừng tại Việt Nam (Bộ NN&PTNT, 2004). Nhiều chương trình nghiên cứu khoa học và dự án hỗ trợ phát triển ngành đã chọn Mây nếp là đối tượng chính. Tuy nhiên, kết quả mới chỉ phản ánh một phần nhỏ sự thích nghi của lồi tại khu vực nghiên cứu, cịn việc giải thích tại sao lại có sự sai khác về sinh trưởng phát triển của loài chưa thực sự khoa học, chính xác và đầy đủ.
Hiện nay, Mây nếp là loài cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc như Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An và Hà Tĩnh với sản lượng
ước tính 1500 - 2000 tấn/năm (Phạm Văn Điển, 2005) [18]. Phương thức trồng chủ yếu là xung quanh nhà và trong các vườn hộ gia đình.
Hiện nay, tại Hồ Bình (huyện Cao Phong), Hà Giang (huyện Hồng Su Phì, Mèo Vạc và Bắc Quang), Hà Tĩnh (huyện Hương Sơn), Quảng Ngãi (huyện Ba Tơ, Sơn Tây, Trà Bồng và Minh Long) và Gia Lai (huyện Con Hà Nừng và Chư Sê) đã trồng mây với diện tích hàng trăm hecta mỗi tỉnh, phương thức trồng chủ yếu dưới tán và theo lối quảng canh (Phạm Văn Điển, 2006).
Kết quả khảo sát các mơ hình gây trồng Mây nếp cho thấy các mơ hình trồng Mây nếp dưới tán rừng hầu hết mới chỉ dừng lại ở các cơng trình nghiên cứu khoa học mang tính thử nghiệm, thời gian theo dõi ngắn, việc chăm sóc và bảo vệ mơ hình sau khi đề tài kết thúc khơng được chú trọng, thêm vào đó cơng tác thơng tin, tuyên truyền và chuyển giao kỹ thuật chưa tốt nên kết quả chưa được áp dụng trên diện rộng.
Trong vườn hộ ở nhiều nơi đã gây trồng Mây nếp thành công nhưng kỹ thuật gây trồng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người dân và trồng với qui mô nhỏ. Tuy nhiên, mức độ phát triển vùng trồng Mây nếp của các địa phương khác nhau mà nguyên nhân chính là do nhận thức của người dân về giá trị của lồi cây này cịn hạn chế, cùng với sự phát triển của các làng nghề mây tre đan.
Phạm Văn Điển (2006) [4], trong “Bảo tồn và phát triển thực vật cho lâm sản ngoài gỗ” cũng đã đề xuất kỹ thuật trồng Mây nếp. Quy trình đã đề cập khâu chọn giống, thu hái, bảo quản, xử lý hạt và tạo cây con. Tuy nhiên, do chưa có những nghiên cứu kỹ về đặc điểm sinh vật học, sinh thái học, mối quan hệ giữa lập địa và sinh trưởng của Mây nếp cho nên hướng dẫn chọn điều kiện lập địa để gây trồng Mây nếp mới chỉ mang tính định hướng .
Lê Thu Hiền, Nguyễn Tử Kim và Lưu Quốc Thành (2001) đã nghiên cứu thiết lập mơ hình trồng Song mật (C. platyacanthus) và Mây nếp (C.
tetradactylus) dưới tán rừng phục hồi tại Trung tâm Thực nghiệm Lâm sinh
Cầu Hai và Trạm Nghiên cứu Mơi trường rừng phịng hộ Sông Đà. Các kết quả nghiên cứu cho thấy Mây nếp và Song mật sinh trưởng và phát triển tốt dưới tán rừng phục hồi có độ tàn che là 0,4 - 0,5. Điều kiện tự nhiên như nhiệt độ trung bình từ 21,60C - 26,60C, lượng mưa từ 1800 mm - 2100 mm, độ cao từ 80 - 400m so với mực nước biển, loại đất feralit phát triển trên đá phiến thạch sét, đất xám kết von, đất dốc tụ, bồi tụ và địa hình bằng phẳng gần khe suối, thung lũng, sườn đồi phù hợp với yêu cầu sinh thái của cây Mây nếp.
Cuối năm 2005 Công ty cổ phần Phát Triển Mây Song - Dũng Tấn tỉnh Thái Bình đã chọn tạo được giống Mây nếp K83 từ nguồn giống địa phương. Hiện nay, Mây nếp K83 được trồng trình diễn khảo nghiệm và cho hiệu quả số thu lãi ròng 70 - 100 triệu đồng/ha/năm. Giống Mây nếp K83 đã được tặng 2 Huy chương vàng Quốc gia - Thương hiệu được bảo hộ độc quyền phát hành, cây giống sản xuất bởi quy trình cơng nghệ mới. Kết quả nghiên cứu cho thấy Mây nếp K83 dễ thích ứng với nhiều điều kiện lập địa, nhiều vùng khí hậu khác nhau. Trồng thâm canh cây có năng suất cao, thân thịt dẻo mềm dễ gia công sản xuất, thời gian thu hoạch sau 5 năm. Phương thức trồng chủ yếu là theo phương thức nông lâm kết hợp, mật độ trồng 40 - 50 ngàn cây/ha. Hiện nay mỗi năm công ty đã sản xuất và cung ứng hàng triệu cây giống cho nhiều địa phương trên cả nước. Tuy nhiên, giống Mây nếp K83 chủ yếu trồng thâm canh trên đất nông nghiệp, mức đầu tư trong thời gian 4 năm đầu tại Kiến Xương - Thái Bình, trung bình trên 20 triệu đồng/ha. Mơ hình trồng dưới tán rừng mới triển khai thí điểm tại Sơn Động - Bắc Giang nhưng chưa có kết quả đánh giá cụ thể.
Ngoài ra, Nguyễn Minh Thanh và cộng sự (2009), sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền của một số xuất xứ loài Mây nếp đã chỉ ra rằng mức độ đa dạng di truyền thấp của lồi Mây nếp [9].
Tóm lại, nhiều cơng trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội dung cơ bản trồng, chăm sóc, hiệu quả kinh tế ... mà chưa có cơng trình nghiên cứu nào cơng bố chi tiết về phương thức nhân giống in vitro Mây nếp. Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới đã giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới việc nuôi cấy in vitro Mây, nhưng có ít tác giả nghiên cứu đầy đủ và xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho loài Mây nếp. Do vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là việc làm cần thiết và có ý nghĩa để nhân nhanh giống tốt loài cây này.
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các thông số kỹ thuật làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống in vitro loài mây nếp (Calamus tettradactylus Hance)
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro từ hạt và chồi măng cây mây nếp - Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu kỹ thuật kích thích tăng trưởng chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống của cây mây nếp in vitro ngoài vườn ươm
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Theo những cơng trình đã cơng bố, vật liệu nhân giống có hiệu quả đối với cây mây là chồi măng và phơi hạt. Do đó trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng chồi măng và phôi hạt được thu thập tại Hịa Bình, Hà Nội.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm Trung tâm Giống & Cơng nghệ sinh học, Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp
2.5. Thiết bị và hóa chất
- Thiết bị: đề tài sử dụng các thiết bị, máy móc của Trung tâm Giống &
Công nghệ sinh học, Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp, gồm: các loại box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nước cất một lần, hai lần, máy chuẩn pH, máy khuấy từ, dàn nuôi cây và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech,...
- Hóa chất: Mơi trường sử dụng ni cấy in vitro cây mây nếp là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) cải tiến, các hóa chất được thể hiện ở
phần phụ lục; các loại vitamin (B1, B6, vitamin C); các chất điều hòa sinh trưởng BAP (6- benzyl amino purine), Kin (Kinetin), IBA (indol – 3- butyric acid), NAA (naphthyl acetic acid), GA3 (gibberellic acid), than hoạt tính... được cung cấp bởi các hãng uy tín và chất lượng trên thế giới như Sigma, Research oganic (Mỹ), Mark (Đức), Wako (Nhật).
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.6.1.1. Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro Mây nếp từ phôi hạt - Thu mẫu và xử lý mẫu: Quả chín thu hoạch sau khi thu về được loại - Thu mẫu và xử lý mẫu: Quả chín thu hoạch sau khi thu về được loại bỏ phần thịt, rửa sạch bằng nước xà phịng lỗng trong 10 phút, sau đó được rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Hạt mây nếp là loại hạt có vỏ ngoài rất cứng, theo nghiên cứu của Zeng Bingshan và cộng sự (1993) [44], hạt của loài Calamus tetradactylus Hance để loại bỏ hết vi khuẩn, nấm bệnh tạo
nguồn mẫu sạch phải ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Yusoff, A.M (1992) [42], khử trùng bằng Javen phù hợp cho khử trùng hạt, ít làm phơi hạt bị chết nhưng vẫn đảm bảo được khả năng diệt nguồn nấm bệnh của hạt mang từ bên ngồi vào.
Bảng 2.1. Các cơng thức thí nghiệm khử trùng phơi hạt mây nếp
Cơng thức
thí nghiệm Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) KT1 HgCl2 0,1 5 KT2 10 KT3 15 KT4 NaClO 60 10 KT5 15 KT6 20 KT7 100 5 KT8 10 KT9 15
Hạt mây nếp được khử trùng bằng cồn 700 trong thời gian 2 phút, loại bỏ cồn bằng nước cất vơ trùng 3 lần. Sau đó, khử trùng theo các cơng thức từ KT1- KT9, loại bỏ các chất khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 lần, thấm khô hạt bằng giấy thấm vô trùng. Dùng panh vô trùng cấy hạt đã được làm khô vào mơi trường MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng. Mỗi cơng thức thí nghiệm cấy 30 hạt, lặp lại 3 lần.
2.6.1.2. Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro Mây nếp từ chồi măng - Thu mẫu và xử lý mẫu: - Thu mẫu và xử lý mẫu:
Tiêu chuẩn chồi được lựa chọn: Chồi có kích thước 15 – 35 (cm), chưa ra lá thật. Được tách từ cây mẹ vào ngày nắng ráo, không mưa.
Chồi măng mây nếp sau khi thu về, loại bỏ hết gai, phần bẹ lá già ở ngoài; sử dụng chổi rửa chuyên dụng, dùng xà phịng lỗng để loại bỏ sơ bộ nguồn nấm bệnh bám vào mẫu vật và cho vào bình thủy tinh lắc mạnh với nước xà phịng lỗng trong 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Bóc 1 đến 2 lớp bẹ lá, sau đó chuyển vào Box cấy khử trùng.
Theo nghiên cứu của Zeng Bingshan (1998) [45] tỷ lệ chất gây nhiễm ở chồi măng của các loài song mây rất cao, do chúng có rất nhiều bẹ lá bao xung quanh đỉnh sinh trưởng, giữa các bẹ lá đó thường tồn tại vi khuẩn khiến cho q trình khử trùng tạo mẫu sạch trong ni cấy in vitro gặp nhiều khó
khăn. Phương thức khử trùng mang lại hiệu quả cao có thể lên đến hơn 60% là khử trùng hai lần. Tùy theo kích thước của mẫu cấy có thể xác định thời gian khử trùng cho từng mẫu cụ thể, thông thường thì mẫu cấy có kích thước nhỏ có tỷ lệ tạo mẫu sạch cao hơn mẫu có kích thước lớn. Kích thước được sử dụng là 1 cm2.
Chồi măng mây nếp được đưa vào tủ cấy vô trùng, rửa sạch bằng nước