Hiện nay, Mây nếp là một trong những loài được lựa chọn ưu tiên cho các chương trình trồng rừng tại Việt Nam (Bộ NN&PTNT, 2004). Nhiều chương trình nghiên cứu khoa học và dự án hỗ trợ phát triển ngành đã chọn Mây nếp là đối tượng chính. Tuy nhiên, kết quả mới chỉ phản ánh một phần nhỏ sự thích nghi của loài tại khu vực nghiên cứu, còn việc giải thích tại sao lại có sự sai khác về sinh trưởng phát triển của loài chưa thực sự khoa học, chính xác và đầy đủ.
Hiện nay, Mây nếp là loài cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc như Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An và Hà Tĩnh với sản lượng
ước tính 1500 - 2000 tấn/năm (Phạm Văn Điển, 2005) [18]. Phương thức trồng chủ yếu là xung quanh nhà và trong các vườn hộ gia đình.
Hiện nay, tại Hoà Bình (huyện Cao Phong), Hà Giang (huyện Hoàng Su Phì, Mèo Vạc và Bắc Quang), Hà Tĩnh (huyện Hương Sơn), Quảng Ngãi (huyện Ba Tơ, Sơn Tây, Trà Bồng và Minh Long) và Gia Lai (huyện Con Hà Nừng và Chư Sê) đã trồng mây với diện tích hàng trăm hecta mỗi tỉnh, phương thức trồng chủ yếu dưới tán và theo lối quảng canh (Phạm Văn Điển, 2006).
Kết quả khảo sát các mô hình gây trồng Mây nếp cho thấy các mô hình trồng Mây nếp dưới tán rừng hầu hết mới chỉ dừng lại ở các công trình nghiên cứu khoa học mang tính thử nghiệm, thời gian theo dõi ngắn, việc chăm sóc và bảo vệ mô hình sau khi đề tài kết thúc không được chú trọng, thêm vào đó công tác thông tin, tuyên truyền và chuyển giao kỹ thuật chưa tốt nên kết quả chưa được áp dụng trên diện rộng.
Trong vườn hộ ở nhiều nơi đã gây trồng Mây nếp thành công nhưng kỹ thuật gây trồng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người dân và trồng với qui mô nhỏ. Tuy nhiên, mức độ phát triển vùng trồng Mây nếp của các địa phương khác nhau mà nguyên nhân chính là do nhận thức của người dân về giá trị của loài cây này còn hạn chế, cùng với sự phát triển của các làng nghề mây tre đan.
Phạm Văn Điển (2006) [4], trong “Bảo tồn và phát triển thực vật cho lâm sản ngoài gỗ” cũng đã đề xuất kỹ thuật trồng Mây nếp. Quy trình đã đề cập khâu chọn giống, thu hái, bảo quản, xử lý hạt và tạo cây con. Tuy nhiên, do chưa có những nghiên cứu kỹ về đặc điểm sinh vật học, sinh thái học, mối quan hệ giữa lập địa và sinh trưởng của Mây nếp cho nên hướng dẫn chọn điều kiện lập địa để gây trồng Mây nếp mới chỉ mang tính định hướng .
Lê Thu Hiền, Nguyễn Tử Kim và Lưu Quốc Thành (2001) đã nghiên cứu thiết lập mô hình trồng Song mật (C. platyacanthus) và Mây nếp (C. tetradactylus) dưới tán rừng phục hồi tại Trung tâm Thực nghiệm Lâm sinh Cầu Hai và Trạm Nghiên cứu Môi trường rừng phòng hộ Sông Đà. Các kết quả nghiên cứu cho thấy Mây nếp và Song mật sinh trưởng và phát triển tốt dưới tán rừng phục hồi có độ tàn che là 0,4 - 0,5. Điều kiện tự nhiên như nhiệt độ trung bình từ 21,60C - 26,60C, lượng mưa từ 1800 mm - 2100 mm, độ cao từ 80 - 400m so với mực nước biển, loại đất feralit phát triển trên đá phiến thạch sét, đất xám kết von, đất dốc tụ, bồi tụ và địa hình bằng phẳng gần khe suối, thung lũng, sườn đồi phù hợp với yêu cầu sinh thái của cây Mây nếp.
Cuối năm 2005 Công ty cổ phần Phát Triển Mây Song - Dũng Tấn tỉnh Thái Bình đã chọn tạo được giống Mây nếp K83 từ nguồn giống địa phương. Hiện nay, Mây nếp K83 được trồng trình diễn khảo nghiệm và cho hiệu quả số thu lãi ròng 70 - 100 triệu đồng/ha/năm. Giống Mây nếp K83 đã được tặng 2 Huy chương vàng Quốc gia - Thương hiệu được bảo hộ độc quyền phát hành, cây giống sản xuất bởi quy trình công nghệ mới. Kết quả nghiên cứu cho thấy Mây nếp K83 dễ thích ứng với nhiều điều kiện lập địa, nhiều vùng khí hậu khác nhau. Trồng thâm canh cây có năng suất cao, thân thịt dẻo mềm dễ gia công sản xuất, thời gian thu hoạch sau 5 năm. Phương thức trồng chủ yếu là theo phương thức nông lâm kết hợp, mật độ trồng 40 - 50 ngàn cây/ha. Hiện nay mỗi năm công ty đã sản xuất và cung ứng hàng triệu cây giống cho nhiều địa phương trên cả nước. Tuy nhiên, giống Mây nếp K83 chủ yếu trồng thâm canh trên đất nông nghiệp, mức đầu tư trong thời gian 4 năm đầu tại Kiến Xương - Thái Bình, trung bình trên 20 triệu đồng/ha. Mô hình trồng dưới tán rừng mới triển khai thí điểm tại Sơn Động - Bắc Giang nhưng chưa có kết quả đánh giá cụ thể.
Ngoài ra, Nguyễn Minh Thanh và cộng sự (2009), sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền của một số xuất xứ loài Mây nếp đã chỉ ra rằng mức độ đa dạng di truyền thấp của loài Mây nếp [9].
Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội dung cơ bản trồng, chăm sóc, hiệu quả kinh tế ... mà chưa có công trình nghiên cứu nào công bố chi tiết về phương thức nhân giống in vitro Mây nếp. Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới đã giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới việc nuôi cấy in vitro Mây, nhưng có ít tác giả nghiên cứu đầy đủ và xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho loài Mây nếp. Do vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là việc làm cần thiết và có ý nghĩa để nhân nhanh giống tốt loài cây này.
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các thông số kỹ thuật làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống in vitro loài mây nếp (Calamus tettradactylus Hance)
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro từ hạt và chồi măng cây mây nếp - Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu kỹ thuật kích thích tăng trưởng chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống của cây mây nếp in vitro ngoài vườn ươm
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Theo những công trình đã công bố, vật liệu nhân giống có hiệu quả đối với cây mây là chồi măng và phôi hạt. Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chồi măng và phôi hạt được thu thập tại Hòa Bình, Hà Nội.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học, Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp
2.5. Thiết bị và hóa chất
- Thiết bị: đề tài sử dụng các thiết bị, máy móc của Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học, Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp, gồm: các loại box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nước cất một lần, hai lần, máy chuẩn pH, máy khuấy từ, dàn nuôi cây và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech,...
- Hóa chất: Môi trường sử dụng nuôi cấy in vitro cây mây nếp là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) cải tiến, các hóa chất được thể hiện ở
phần phụ lục; các loại vitamin (B1, B6, vitamin C); các chất điều hòa sinh trưởng BAP (6- benzyl amino purine), Kin (Kinetin), IBA (indol – 3- butyric acid), NAA (naphthyl acetic acid), GA3 (gibberellic acid), than hoạt tính... được cung cấp bởi các hãng uy tín và chất lượng trên thế giới như Sigma, Research oganic (Mỹ), Mark (Đức), Wako (Nhật).
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.6.1.1. Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro Mây nếp từ phôi hạt - Thu mẫu và xử lý mẫu: Quả chín thu hoạch sau khi thu về được loại - Thu mẫu và xử lý mẫu: Quả chín thu hoạch sau khi thu về được loại bỏ phần thịt, rửa sạch bằng nước xà phòng loãng trong 10 phút, sau đó được rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Hạt mây nếp là loại hạt có vỏ ngoài rất cứng, theo nghiên cứu của Zeng Bingshan và cộng sự (1993) [44], hạt của loài Calamus tetradactylus Hance để loại bỏ hết vi khuẩn, nấm bệnh tạo nguồn mẫu sạch phải ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Yusoff, A.M (1992) [42], khử trùng bằng Javen phù hợp cho khử trùng hạt, ít làm phôi hạt bị chết nhưng vẫn đảm bảo được khả năng diệt nguồn nấm bệnh của hạt mang từ bên ngoài vào.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm khử trùng phôi hạt mây nếp
Công thức
thí nghiệm Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) KT1 HgCl2 0,1 5 KT2 10 KT3 15 KT4 NaClO 60 10 KT5 15 KT6 20 KT7 100 5 KT8 10 KT9 15
Hạt mây nếp được khử trùng bằng cồn 700 trong thời gian 2 phút, loại bỏ cồn bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, khử trùng theo các công thức từ KT1- KT9, loại bỏ các chất khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 lần, thấm khô hạt bằng giấy thấm vô trùng. Dùng panh vô trùng cấy hạt đã được làm khô vào môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Mỗi công thức thí nghiệm cấy 30 hạt, lặp lại 3 lần.
2.6.1.2. Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro Mây nếp từ chồi măng - Thu mẫu và xử lý mẫu: - Thu mẫu và xử lý mẫu:
Tiêu chuẩn chồi được lựa chọn: Chồi có kích thước 15 – 35 (cm), chưa ra lá thật. Được tách từ cây mẹ vào ngày nắng ráo, không mưa.
Chồi măng mây nếp sau khi thu về, loại bỏ hết gai, phần bẹ lá già ở ngoài; sử dụng chổi rửa chuyên dụng, dùng xà phòng loãng để loại bỏ sơ bộ nguồn nấm bệnh bám vào mẫu vật và cho vào bình thủy tinh lắc mạnh với nước xà phòng loãng trong 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Bóc 1 đến 2 lớp bẹ lá, sau đó chuyển vào Box cấy khử trùng.
Theo nghiên cứu của Zeng Bingshan (1998) [45] tỷ lệ chất gây nhiễm ở chồi măng của các loài song mây rất cao, do chúng có rất nhiều bẹ lá bao xung quanh đỉnh sinh trưởng, giữa các bẹ lá đó thường tồn tại vi khuẩn khiến cho quá trình khử trùng tạo mẫu sạch trong nuôi cấy in vitro gặp nhiều khó khăn. Phương thức khử trùng mang lại hiệu quả cao có thể lên đến hơn 60% là khử trùng hai lần. Tùy theo kích thước của mẫu cấy có thể xác định thời gian khử trùng cho từng mẫu cụ thể, thông thường thì mẫu cấy có kích thước nhỏ có tỷ lệ tạo mẫu sạch cao hơn mẫu có kích thước lớn. Kích thước được sử dụng là 1 cm2.
Chồi măng mây nếp được đưa vào tủ cấy vô trùng, rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần, ngâm mẫu trong dung dịch cồn 700 trong thời gian 2 phút, loại bỏ cồn bằng cách rửa sạch mẫu với nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, khử trùng lần 1 bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút, loại bỏ HgCl2 bằng nước cất vô trùng 5 lần. Dùng panh, dao vô trùng cắt loại bỏ phần lớp bẹ bên ngoài. Tiếp
tục khử trùng mẫu lần 2 theo các công thức khử trùng từ K10 – K13, loại bỏ chất khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 lần. Thấm khô mẫu, loại bỏ phần mẫu bị chết, cấy chuyển vào môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Mỗi công thức thí nghiệm 30 mẫu, lặp lại 3 lần.
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm khử trùng chồi măng mây nếp
Khử trùng lần 1 Khử trùng lần 2
Công thức khử trùng
Chất khử
trùng Thời gian khử trùng (phút) Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) KT10 HgCl2 0,1% 8 HgCl2 0,1% 1 KT11 2 KT12 3 KT13 4 HT14 5
Các mẫu sạch tạo được sau 4 tuần nuôi cấy được chuyển sang môi trường mới để kích thích mẫu nảy chồi. Thành phần môi trường nuôi cấy: MS cải tiến + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA [45].
2.6.1.3. Phương pháp nghiên cứu tạo cụm chồi mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro cấy in vitro
Cytokinin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các Cytokinin thường gặp là Kinetin, BAP. Trong đó, Kinetin là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin, BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra, các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym.
Theo nghiên cứu của Zeng Bingshan (1999) [46], nuôi cấy in vitro các loài song mây, nhóm Cytokinin có tác dụng mạnh đến quá trình hình thành chồi, trong đó BAP có tác dụng gấp 5 – 10 lần Kinetin trong quá trình tạo
chồi. Nồng độ BAP thích hợp cho hầu hết các loài song mây là 1 – 4 (mg/l). Trong nội dung nghiên cứu tạo cụm chồi mây nếp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu 2 nội dung sau:
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp:
Thí nghiệm được thiết kế theo thí nghiệm 2 nhân tố: nhân tố 1 là môi trường dinh dưỡng với thành phần khoáng đa lượng thay đổi theo 3 cấp: 1MS; 1,5MS và 2MS, nhân tố 2 là nồng độ BAP (mg/lít) gồm 7 cấp: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tổng số công thức thí nghiệm gồm 21 công thức.
Bảng 2.3: Các công thức thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và nồng độ BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
CTTN Môi trường dinh dưỡng BAP (mg/l)
CC1 1MS 0 CC2 1MS 1 CC3 1MS 2 CC4 1MS 3 CC5 1MS 4 CC6 1MS 5 CC7 1MS 6 CC8 1,5MS 0 CC9 1,5MS 1 CC10 1,5MS 2 CC11 1,5MS 3 CC12 1,5MS 4 CC13 1,5MS 5 CC14 1,5MS 6
CC15 2MS 0 CC16 2MS 1 CC17 2MS 2 CC18 2MS 3 CC19 2MS 4 CC20 2MS 5 CC21 2MS 6
Ảnh hưởng của tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức, các công thức được thực hiện trên môi trường: MS cải tiến + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose
Bảng 2.4: Công thức thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và Kinetin CTTN Môi trường dinh dưỡng BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) M1 0,125 M2 0,250 M3 0,400 M4 0,500
Ghi chú: Môi trường dinh dưỡng và nồng độ BAP dựa trên kết quả của thí nghiệm 1.
2.6.1.4. Phương pháp nghiên cứu kích thích tăng trưởng chồi
Kích thích tăng trưởng chồi là điều quan trọng trong nuôi cấy tái sinh các loài song mây. Chồi “lùn” chỉ có bẹ lá mà không có lá. Trong nuôi cấy in vitro, chồi của C. simplicifolius và C. egregius không thể hình thành lá khi chiều cao của chúng không đạt đến 3,5 cm trở lên, chiều cao chồi của D. margaritae và D.jenkinsiana là ≥ 3,5 cm [45]. Đối với các loài song mây, để
thành công trong việc đưa cây ra trồng là cây phải có ít nhất 1 đến 2 lá. Kéo dài lóng là điều kiện cần thiết để tạo rễ ở nhiều loài. Mặc dầu, chiều dài thân không phải là điều kiện tiên quyết cho sự tạo rễ của song mây, nhưng nó có ảnh hưởng đến quá trình này và chiều dài của rễ thu được.
Kéo dài chồi trong quá trình nuôi cấy in vitro các loài song mây bị hạn chế bởi Auxin và Cytokinin, thậm chí ở nồng độ thấp. Gibberellic acid (GA3) kích thích kéo dài chồi và bẹ lá của D. margaritae, D. jenkinsiana và C. simplicifolius khi nuôi cấy in vitro. Nồng độ thích hợp nhất là 1mg/l, khi nồng độ cao hơn 2 mg/l, chồi của D. margaritae và D. jenkinsiana trở nên mềm và xanh xám [45].
Các cụm chồi thu được ở giai đoạn tạo cụm chồi được chuyển vào môi