Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1.2. Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro Mây nếp từ chồi măng
- Thu mẫu và xử lý mẫu:
Tiêu chuẩn chồi được lựa chọn: Chồi có kích thước 15 – 35 (cm), chưa ra lá thật. Được tách từ cây mẹ vào ngày nắng ráo, không mưa.
Chồi măng mây nếp sau khi thu về, loại bỏ hết gai, phần bẹ lá già ở ngoài; sử dụng chổi rửa chuyên dụng, dùng xà phịng lỗng để loại bỏ sơ bộ nguồn nấm bệnh bám vào mẫu vật và cho vào bình thủy tinh lắc mạnh với nước xà phịng lỗng trong 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Bóc 1 đến 2 lớp bẹ lá, sau đó chuyển vào Box cấy khử trùng.
Theo nghiên cứu của Zeng Bingshan (1998) [45] tỷ lệ chất gây nhiễm ở chồi măng của các loài song mây rất cao, do chúng có rất nhiều bẹ lá bao xung quanh đỉnh sinh trưởng, giữa các bẹ lá đó thường tồn tại vi khuẩn khiến cho q trình khử trùng tạo mẫu sạch trong ni cấy in vitro gặp nhiều khó
khăn. Phương thức khử trùng mang lại hiệu quả cao có thể lên đến hơn 60% là khử trùng hai lần. Tùy theo kích thước của mẫu cấy có thể xác định thời gian khử trùng cho từng mẫu cụ thể, thơng thường thì mẫu cấy có kích thước nhỏ có tỷ lệ tạo mẫu sạch cao hơn mẫu có kích thước lớn. Kích thước được sử dụng là 1 cm2.
Chồi măng mây nếp được đưa vào tủ cấy vô trùng, rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần, ngâm mẫu trong dung dịch cồn 700 trong thời gian 2 phút, loại bỏ cồn bằng cách rửa sạch mẫu với nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, khử trùng lần 1 bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút, loại bỏ HgCl2 bằng nước cất vô trùng 5 lần. Dùng panh, dao vô trùng cắt loại bỏ phần lớp bẹ bên ngoài. Tiếp
tục khử trùng mẫu lần 2 theo các công thức khử trùng từ K10 – K13, loại bỏ chất khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 lần. Thấm khô mẫu, loại bỏ phần mẫu bị chết, cấy chuyển vào môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Mỗi cơng thức thí nghiệm 30 mẫu, lặp lại 3 lần.
Bảng 2.2. Các cơng thức thí nghiệm khử trùng chồi măng mây nếp
Khử trùng lần 1 Khử trùng lần 2
Công thức khử trùng
Chất khử
trùng Thời gian khử trùng (phút) Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) KT10 HgCl2 0,1% 8 HgCl2 0,1% 1 KT11 2 KT12 3 KT13 4 HT14 5
Các mẫu sạch tạo được sau 4 tuần nuôi cấy được chuyển sang mơi trường mới để kích thích mẫu nảy chồi. Thành phần mơi trường ni cấy: MS cải tiến + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA [45].