Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.2.1. Phương pháp thu thập số liệu
- Tạo mẫu sạch in vitro: + Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu nhiễm: Tỷ lệ mẫu sạch: Tỷ lệ mẫu nảy mầm:
+ Thời điểm thu thập số liệu: Sau 02 tuần, 04 tuần nuôi cấy. - Tạo cụm chồi:
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu cấy tạo cụm chồi, thời gian tạo cụm chồi + Thời điểm thu thập số liệu: Sau 04 tuần ni cấy
- Kích thích tăng trưởng chồi:
+ Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi, số lá/chồi + Thời điểm thu thập số liệu: sau 04 tuần nuôi cấy
- Tạo cây hoàn chỉnh
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/ chồi, chiều dài rễ, số chồi tạo rễ, chiều cao cây Cách đo kích thước cây con: để cây con đặt nằm tự nhiên, kích thước
cây con được đo bằng khoảng cách từ nơi cao nhất ra rễ tới mặt lá cao nhất
Cách đo tổng kích thước rễ: chiều dài rễ tính từ thân cây con tới đầu chóp rễ, đo dần từng rễ, cộng tổng ra tổng kích thước rễ.
+ Thời điểm thu thập số liệu: Quan sát thời gian xuất hiện rễ, thống kê số liệu sau 4 tuần nuôi cấy.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống của cây mây nếp in vitro ngoài vườn ươm:
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số cây sống, số cây chết
+ Thời gian thu thập số liệu: Sau 04 tuần và 08 tuần chăm sóc. 2.6.2.2. Phương pháp xử lý số liệu: - Tỷ lệ mẫu sạch = Số mẫu sạch ×100 Tổng số mẫu cấy - Tỷ lệ mẫu nảy mầm = Số mẫu nảy mầm ×100 Tổng số mẫu cấy
- Tỷ lệ mẫu nhiễm = Số mẫu nhiễm ×100 Tổng số mẫu cấy
- Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi = Số mẫu tạo cụm chồi ×100 Tổng số mẫu cấy
- Tỷ lệ mẫu tạo rễ = Số mẫu tạo rễ × 100 Tổng số mẫu cấy
- Tỷ lệ cây sống =
Số cây sống
× 100 Tổng số cây cấy
- Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5 (Nguyễn Hải Tuất, Vũ Tiến Hinh và Ngô Kim Khôi, 2006) [16], [17].
- Tính tốn các đặc trưng mẫu + Trung bình X = m i i iX f n 1 1
+ Sai tiêu chuẩn SX = 2 ) ( 1 1 X X f n i m i + Hệ số biến động V% = *100 X SX
+ Phạm vi biến động R = Xmax - Xmin
- Kiểm tra sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm bằng phân tích phương sai một nhân tố và hai nhân tố.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt và chồi măng Mây nếp
3.1.1. Tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt mây nếp
Trong nhân giống in vitro, tạo mẫu sạch được coi là một trong những khâu quan trọng nhất. Kết quả và tiến độ các bước tiếp theo của quy trình phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng và chất lượng nguồn mẫu sạch tạo được.
Các hóa chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu cấy là HgCl2;
Ca(OCl2)2 và NaOCl. Tùy từng loài cây, loại mẫu khử trùng mà sử dụng các loại hóa chất với nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau. Song mây nói chung và mây nếp nói riêng là lồi cây có vỏ hạt rất cứng, nhưng phơi nằm ngay ngồi vỏ hạt nên rất gặp khó khăn trong q trình khử trùng mẫu hạt. Trong nghiên cứu của Zeng binhshan, tác giả sử dụng HgCl2 0,1 % trong 10 phút để khử trùng hạt cho hiệu quả khử trùng cao. Theo một số nghiên cứu của các tác giả khác, khi sử dụng Javen để khử trùng hạt cũng mang lại những hiệu quả nhất định. Vì chúng khơng độc, ít tác dụng đến phơi nên khơng dẫn đến việc phôi bị chết và không gây các biến dị phôi. Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng đồng thời 2 chất HgCl2 0,1% và Javen ở các nồng độ 60% và 100% để khử trùng mẫu hạt mây nếp. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS (khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng) + 8 g/lít agar + 30 g/lit đường saccarose được tổng hợp ở bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro hạt mây nếp Chất khử trùng Nồng độ Thời gian (phút) Số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) HgCl2 0,1% 5 90 67,74 32,26 54,84 12,90 10 90 68,75 31,25 53,13 15,63
15 90 75,00 25,00 43,75 31,25 NaClO 60% 5 90 60,00 40,00 57,14 2,86 10 90 68,75 31,25 56,25 12,50 15 90 75,00 25,00 53,13 21,88 100% 5 90 58,82 41,18 55,88 2,94 10 90 75,00 25,00 53,13 21,88 15 90 83,33 16,67 50,00 33,33
Kết quả tổng hợp ở bảng 3.1 cho thấy: Khi dùng HgCl2 với nồng độ 0,1% tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn so với sử dụng NaClO (nồng độ 60%, 100%). (Tỷ lệ mẫu nhiễm khi sử dụng HgCl2 cao nhất là 32,26% trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất khi sử dụng NaClO là 41,18%). Khi sử dụng chất khử trùng là HgCl2 0,1% tỷ lệ mẫu sạch thu được cao hơn khi sử dụng chất khử trùng NaClO (60%, 100%) nhưng tỷ lệ mẫu bị chết, tỷ lệ mẫu không nảy mầm cao hơn. Tỷ lệ mẫu nảy mầm khi dùng NaClO đạt cao nhất là 57,14% trong khi HgCl2 chỉ đạt 54,48%. Điều này phản ánh rõ hơn về đặc điểm sinh học của hạt mây nếp do chúng có phần phơi nằm ngay bề mặt hạt nên dễ bị tổn thương khi dùng các chất khử trùng có tính độc cao như HgCl2. Từ kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng biện pháp khử trùng bằng NaClO trong các nghiên cứu tiếp theo.
Khử trùng mẫu hạt bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian 5, 10 và 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch lần lượt là 67,74%; 68,75% và 75% nhưng tỷ lệ mẫu nảy mầm lại giảm dần từ 54,84%, 53,13%, 43,75%. Điều này cho thấy khi tăng thời gian khử trùng đối với mẫu hạt tỷ lệ mẫu nảy mầm giảm xuống do ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 (gây độc cho mẫu). Thời gian khử trùng cho tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất (32,26%) trong các công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% là 5 phút nhưng tỷ lệ mẫu nảy mầm thu được là cao nhất 54,84%. Ngược lại với công thức khử trùng trong 15 phút tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 75% nhưng tỷ lệ
mẫu chết cao nhất 31,25%. Như vậy đối với chất khử trùng bằng HgCl2 thì cơng thức khử trùng tốt nhất là trong 10 phút với tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt 53,13%.
Khử trùng mẫu hạt mây nếp bằng dung dịch NaClO cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao hơn 50%. Tỷ lệ mẫu sạch thu được có tỷ lệ mẫu nảy mầm cao, hiện tượng mẫu bị chết chiếm tỷ lệ nhỏ từ 2,86% - 21,88% đối với NaClO 60% và 2,94% - 36,67% khi khử trùng bằng NaClO 100%. Điều này cho thấy khi tăng nồng độ chất khử trùng từ 60% lên 100% đã làm tăng tỷ lệ mẫu bị chết, giảm tỷ lệ mẫu bị nhiễm. Với công thức khử trùng bằng NaClO 60%, thời gian khử trùng tốt nhất là 10 phút và thời gian khử trùng tốt nhất bằng NaClO 100% cũng là 10 phút. Điều này cho thấy nồng độ của chất khử trùng là NaClO có ảnh hưởng khơng lớn đến tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu nảy mầm.
Công thức khử trùng mẫu hạt mây nếp tốt nhất là công thức khử trùng NaClO 60% với thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch 68,75% và tỷ lệ mẫu nảy mầm 56,25%. Chất lượng cây mầm thu được đáp ứng tiêu chuẩn cho các bước nghiên cứu tiếp theo luận văn.
Hình 3.1. Hạt mây nếp nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy
3.1.2. Tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng mây nếp
Tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng là cơng đoạn khá phức tạp, khó khăn hơn so với tạo mẫu sạch từ phôi hạt. Do mây là lồi cây có cấu tạo bẹ lá phức tạp bao đỉnh sinh trưởng. Quá trình tạo mẫu sạch từ chồi măng mang ý nghĩa hơn so với tạo nguồn mẫu sạch từ phơi hạt trong quy trình nhân giống in vitro.Vì cây con
trưởng, phát triển đồng đều trong cùng một điều kiện sinh thái gây trồng. Tuy nhiên, đối với những lồi cây nguồn hạt khơng dồi dào, tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, việc tạo mẫu sạch từ chồi gặp nhiều khó khăn thì phương thức tạo mẫu sạch từ phơi hạt có ý nghĩa quan trọng. Để xây dựng thành cơng một quy trình nhân giống
in vitro cho một lồi cây nào đó, cần thiết phải tạo được một lượng mẫu sạch đáng
kể để tiến hành thí nghiệm. Vì vậy, để nhanh chóng đạt thành cơng, người ta thường tạo nguồn mẫu sạch tạm thời từ phôi hạt để nhằm tối ưu hóa quy trình.
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào cây mây, khử trùng bằng chồi mây thường khó thực hiện hơn so với các đối tượng cây trồng khác, vì đây là đối tượng mới, thân cây có cấu tạo dạng bẹ. Trong nội dung nghiên cứu của chuyên đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các biện pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro tạo điều kiện thuận lợi tạo nguồn nguyên liệu sạch cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trên cơ sở tham khảo các cơng trình khoa học cơng bố về kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro từ chồi cho các loài cây rừng, hầu hết các tác giả cho rằng sử dụng cồn 70O sát khuẩn bề mặt mẫu trong khoảng thời gian ngắn, sau đó dùng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% khử trùng trong 5-10 phút sẽ đạt được hiệu quả tạo mẫu sạch. Dung dịch khử trùng HgCl2 là một chất gây độc cực mạnh đối với tế bào sống. Do vậy trong quá trình khử trùng tạo mẫu chồi in vitro sạch nếu kéo dài
khoảng thời gian khử trùng sẽ thu được tỷ lệ mẫu sạch cao nhưng hầu hết mẫu lại mất khả năng nảy mầm nên khơng có ý nghĩa, nhưng nếu khử trùng trong khoảng thời gian ngắn lại cho tỷ lệ mẫu sạch thấp do thời gian chưa đủ để tiêu diệt hết các mầm bệnh.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng mây nếp
Công thức khử trùng Khử trùng lần 1 Khử trùng lần 2 Số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) KT10 HgCl2 0,1% 8 HgCl2 0,1% 1 30 40,0 60,0 23,3 16,7 KT11 2 30 66,7 33,3 21,0 45,7 KT12 3 30 70,0 30,0 20,0 50,0 KT13 4 30 75,1 24,5 13,2 61,9 KT14 5 30 83,3 16,7 6,7 76,6
Hình 3.2. Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng mây nếp
KT10 KT11 KT12 KT13 KT14 40.0 66.7 70.0 75.1 83.3 60.0 33.3 30.0 24.5 16.7 23.3 21.0 20.0 13.2 6.7 16.7 45.7 50.0 61.9 76.6
Tỷlệmẫu sạch (%) Tỷlệmẫu nhiễm (%) Tỷlệmẫu nảy mầm (%) Tỷlệmẫu chết (%)
Kết quả tổng hợp ở bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy: Tỷ lệ tạo mẫu sạch tăng dần khi tăng thời gian khử trùng mẫu. Ở các công thức từ KT10 – KT14, tỷ lệ tạo mẫu sạch lần lượt là 40%; 66,7%; 70%; 75,1% và 83,3%. Cơng thức khử trùng có ý nghĩa khi mẫu sạch có khả năng sinh trưởng và phát triển tạo nguồn nguyên liệu cho các giai đoạn nghiên cứu sau. Khi khử trùng mẫu là chồi măng mây nếp, tỷ lệ mẫu nảy mầm giảm dần khi tăng thời gian khử trùng, cụ thể 23,3%; 21%; 20%; 13,2% và 6,7% tương ứng ở các công thức khử trùng từ KT10 – KT14. Như vậy, công thức khử trùng chồi măng tốt nhất là KT13 (Phụ biểu 01).
3.2. Tạo cụm chồi mây nếp trong nuôi cấy in vitro
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
Việc tạo được cụm chồi từ chồi của mây nếp trong điều kiện in vitro là dấu hiệu quyết định sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy. Các cụm chồi in vitro hình thành trong giai đoạn này sẽ là nguồn nguyên liệu cho các giai đoạn sau. Chồi in
vitro được tạo ra không chỉ phụ thuộc vào trạng thái non trẻ của mẫu cấy, chất
lượng mẫu cấy, lồi cây mà cịn phụ thuộc vào mơi trường nuôi cấy. Khi mẫu cấy được tách rời đem ni trong các bình, ống nghiệm chúng sẽ khơng có khả năng tự dưỡng được, nếu chúng không được cung cấp các chất dinh dưỡng đầy đủ thì sẽ bị hố nâu và dần dần sẽ chết. Vì vậy để các mẫu cấy có thể tồn tại, phân hố và tiếp tục phát triển trong điều kiện in vitro, các mô, các cơ quan này cần được cung cấp các chất dinh dưỡng. Mặt khác, việc bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin và Cytokinin) vào môi trường sẽ làm tăng hiệu quả tạo cụm chồi in
vitro cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chồi.
Theo các báo cáo đã cơng bố về nhân giống nhiều lồi mây bằng ni cấy
in vitro cho thấy môi trường dinh dưỡng phù hợp để nuôi cấy chồi mây là MS
nhưng tùy vào từng loài cụ thể mà dùng thành phần các chất đa lượng, vi lượng thay đổi cho thích hợp. Chất điều hịa sinh trưởng có ảnh hưởng hiệu quả nhất trong giai đoạn tạo cụm chồi là BAP. Do đó, trên cơ sở các báo cáo cơng bố trên
thế giới và từ thực nghiệm nhân giống mây C. simplicifolius, chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng MS với thành phần khoáng đa lượng thay đổi và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp in vitro.
Theo các nghiên cứu ở các nước, như: Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, Singapo,... vật liệu dùng trong nhân giống in vitro được sử dụng trước tiên là phôi hạt. Từ nguồn mẫu sạch được tạo từ phơi hạt tiến hành nghiên cứu thăm dị khả năng tái sinh, nhân và kích thích tăng trưởng chồi. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được từ loại vật liệu nuôi cấy này, người ta mới tiến hành nuôi cấy các bộ phận sinh dưỡng (chồi măng, chóp rễ, mơ lá...). Như vậy, việc nhân giống từ mẫu phơi hạt được coi là bước tối ưu hóa quy trình kỹ thuật nhân giống sinh dưỡng.
Hơn nữa, vì nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro sẽ cho phép sản
xuất hàng loạt cây con từ mỗi phôi hạt của cây tốt được tuyển chọn, cho nên chỉ cần sử dụng một lượng rất ít cây mẹ tốt nhất để lấy vật liệu nhân giống.
Trong nội dung nghiên cứu này, vật liệu tiến hành các nghiên cứu là các cây in vitro nảy mầm từ phôi hạt, không bị nhiễm khuẩn, nấm. Kết quả cho thấy, sau một tháng nuôi cấy, tỷ lệ tạo cụm chồi trên tất cả cơng thức thí nghiệm là 0%. Kết quả này cũng phù hợp với các báo cáo đã công bố, nhiều tác giả cho biết đối với hầu hết các loài mây để tạo được cụm chồi từ mẫu sạch khởi đầu, chồi phải được cấy chuyển liên tục trên môi trường cảm ứng tạo cụm chồi (cấy chuyển khoảng 3 – 4 lần; ni 20 - 25 ngày thì cấy chuyển một lần).
Sau 3 lần cấy chuyển liên tục, một số chồi đã bắt đầu có dấu hiệu cảm ứng tạo cụm chồi ở hầu hết các cơng thức thí nghiệm. Các chồi này lại tiếp tục cấy chuyển sang môi trường mới. Sau 4 lần cấy chuyển, các cụm chồi đã hình thành rõ rệt, tiến hành thống kê và xử lý số liệu, kết quả thu được tổng hợp ở bảng 3.3. dưới đây:
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
CTTN Môi trường
dinh dưỡng BAP (mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Số chồi TB/cụm Chất lượng chồi CC1 1MS 0 0,00 0,00 -