Mây nếp in vitro
Theo nhiều báo cáo cho thấy, đối với nhiều loài cây trồng nhân giống in vitro nếu kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và kinetin ở hàm lượng nhỏ sẽ mang lại hệ số nhân chồi cao. Trên cơ sở đã xác định được môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất BAP thích hợp cho cảm ứng tạo cụm chồi mây. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và kinetin đến khả năng tạo cụm chồi Mây nếp.
Sau một thời gian nghiên cứu, thống kê và xử lý số liệu, kết quả thu được tổng hợp ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Ảnh hưởng phối hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi
CT Môi trường dinh dưỡng BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Số chồi TB/cụm Chất lượng chồi M1 2 MS 4 0,125 74,25 3,33 ++ M2 4 0,250 74,50 3,85 ++ M3 4 0,400 73,50 4,00 + M4 4 0,500 75,42 3,50 +
Ghi chú: + : Chồi có chất lượng trung bình, chồi có màu xanh nhạt, thấp; ++: Chồi có chất lượng tốt, chồi có màu xanh đậm và vươn cao; - Chồi có chất lượng kém, chồi có màu xanh đậm nhưng nhiều chồi bị biến dị về hình thái (chồi cong keo).
Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố: Ftính = 16,61 > Ftra bảng = 4,07 (Phụ biểu 03) cho thấy tổ hợp giữa BAP và Kinetin có ảnh hưởng khá rõ rệt đến khả năng cảm ứng tạo cụm chồi mây. Ở cả 4 công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi > 73,5% và số chồi trung bình/cụm > 3,3 cao hơn so với mẫu cấy trên môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l BAP ở thí nghiệm trên là 73,08% và 3,18
chồi/cụm. Trên môi trường dinh dưỡng 2MS bổ sung 4 mg/l BAP + 0,125 – 0,5 mg/l Kinetin cho tỷ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi gần ngang nhau, dao động từ 73,50% - 75,42% nhưng số chồi trung bình/cụm và chất lượng chồi thì khác nhau rõ rệt. Ở nồng độ 0,125 và 0,25 (mg/l) Kinetin thu được số chồi trung bình/cụm là 3,33 và 3,85 chồi/cụm, chồi có chất lượng tốt (xanh đậm, vươn cao, chồi điển hình). Còn ở nồng độ 0,4 (mg/l) Kinetin cho kết quả cao nhất 4 chồi/cụm nhưng chồi có chất lượng trung bình (chồi thấp, một số chồi bị biến dị hình thái). Khi tăng nồng độ lên 0,5mg/l Kinetin chỉ thu được 3,5 chồi/cụm, chồi có chất lượng trung bình.
Do vậy có thể kết luận việc bổ sung tổ hợp 4,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin là hiệu quả cho việc tạo cụm chồi mây nếp in vitro.
Hình 3.3. Cụm chồi mây nếp sau 4 tháng nuôi cấy
Kết quả nghiên cứu từ giai đoạn tạo cụm chồi cho thấy, hàm lượng BAP trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo cụm chồi. Nồng độ chất BAP thích hợp nhất để cảm ứng tạo cụm chồi từ nguồn vật liệu khởi đầu là 4 mg/l. Đối với mây, sau khi đã tạo được cụm chồi, các chồi sẽ có sức đẻ thêm chồi mới rất mạnh, thậm chí trên môi trường có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thấp hơn môi trường ban đầu. Trong nhân giống in vitro, nếu chồi đẻ thêm nhiều chồi mới quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến chất lượng chồi (chồi thấp, không tái sinh thành
cây). Trong quá trình nuôi cấy, nếu các chồi mới tạo ra quá nhiều, nhỏ li ti cần giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng 60 – 80%.
Vật liệu nuôi cấy chịu tác động trực tiếp của môi trường nuôi cấy, tùy từng loài cây, yêu cầu cụ thể trong từng giai đoạn mà vật liệu nuôi cấy khác nhau. Song mây với đặc tính sinh trưởng và phát triển theo cụm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng từng loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi mây nếp. Kết quả nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 3.5 dưới đây:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi
Vật liệu nhân nhanh chồi Số chồi tb/cụm Số chồi mới tạo thành tb/cụm Hệ số nhân chồi (lần) Chất lượng chồi Cụm 2 chồi 2,0 7,1 3,55 Tốt Cụm 3 chồi 3,0 10,9 3,63 Tốt Cụm 4 chồi 4,0 15,5 3,88 TB
Trên bảng 3.5 cho thấy: Khi nuôi cấy in vitro mây nếp đặc biệt là giai đoạn nhân nhanh chồi, vật liệu nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đến khả năng tạo chồi mới. Các loài song mây với đặc tính sinh trưởng và phát triển theo cụm, trong quá trình nuôi cấy, cụm 3 chồi cho hệ số nhân chồi cao nhất 3,63 (lần), chất lượng chồi thu được tốt. Khi chỉ nuôi cấy 2 chồi/cụm hệ số nhân chồi là 3,55 (lần), thấp nhất trong các công thức thí nghiệm. Nếu tăng lên 4 chồi/cụm, hệ số nhân chồi đạt 3,88 lần nhưng chất lượng chồi thu được không cao (các chồi không rõ ràng, nhỏ), điều này cho thấy, khi tăng lượng chồi/cụm để nuôi cấy, các chồi mới tạo thành ức chế sinh trưởng lẫn nhau, ảnh hưởng đến chất lượng chồi thu được.
Như vậy, giai đoạn nhân nhanh chồi, số chồi/cụm đưa vào nuôi cấy nhân nhanh có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh chồi. Cụm 3 chồi là vật liệu thích hợp nhất cho hệ số nhân nhanh cao nhất (3,63 lần).
Nhân nhanh chồi là quá trình cấy chuyển nhiều lần để đạt được số lượng chồi mong muốn. Sau quá trình cấy chuyển nhiều lần, các chồi mây xuất hiện hiện tượng nâu hóa, ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh giai đoạn sau và quá trình sinh trưởng, phát triển của chồi. Theo các báo cáo đã công bố, các chất chống oxy hóa như Viatamin C, Cysteine và Polyvinylpyrolidone (PVP) có tác dụng chống nâu hóa trong nuôi cấy in vitro. Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất có khả năng hạn chế quá trình oxy hóa trong quá trình nuôi cấy trên cơ sở công thức môi trường nhân nhanh tốt nhất đã nói trên.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng phối hợp của Viatamin C, Cysteine và Polyvinylpyrolidone đến khả năng chống nâu hoá của cụm chồi mây nếp
CT TN Polyvinylpyrolidone (mg/l) Cysteine (mg/l) Vitamin C (mg/l) Mức độ chồi bị
nâu hóa Chất lượng chồi
Đ/C - - - Nâu, đen Chồi chết dần
K1 200 - - Nâu Chồi không phát triển
K2 300 - - Trắng ngà,
xanh
Chồi vươn cao và phát triển tốt K3 400 - - Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi không phát triển
K4 - 2 5 Nâu Chồi không phát triển
K5 - 2 10 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm K6 - 2 15 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm K7 - 4 5 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm
K8 - 4 10 Trắng ngà, xanh
Chồi vươn cao và phát triển tốt K9 - 4 15 Trắng ngà Chồi rõ và phát triển tốt K10 - 6 5 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm K11 - 6 10 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm K12 - 6 15 Hơi vàng xung quanh phần gốc Chồi phát triển chậm
Kết quả tổng hợp ở bảng 3.6 cho thấy: Các chất chống oxy hóa có ảnh hưởng tốt đến khả năng chống nâu hóa chồi mây. Ở công thức đối chứng (không bổ sung chất chống oxy hóa), các chồi có màu nâu đen và chết dần trong quá trình nuôi cấy, trong khi ở các công thức thí nghiệm từ K1 – K12 bổ sung các chất chống oxy hóa, các chồi sinh trưởng và không có hiện tượng bị nâu hóa.
Các công thức thí nghiệm K1, K2 và K3 bổ sung 200, 300 và 400 (mg/l) PVP có ảnh hưởng rõ đến khả năng chống nâu hóa chồi. Khi nồng độ PVP thấp (200 mg/l), hầu như chưa có tác dụng đến khả năng chống nâu hóa chồi, các chồi thu được vẫn bị hóa nâu và không phát triển được. Khi nồng độ này cao 400mg/l, có tác dụng ức chế sinh trưởng của chồi mây, các chồi thu được có sinh trưởng chậm, phần gốc chồi có màu vàng. Nồng độ PVP có tác dụng tốt nhất đến khả năng chống nâu hóa chồi là 300 mg/l, ở nồng độ này, các chồi có màu trắng ngà- xanh, chồi vươn cao và phát triển tốt.
Theo nhiều báo cáo đã công bố Cysteine và Vitamin C có tác dụng hỗ trợ nhau trong các nghiên cứu chống oxy hóa. Trong nội dung nghiên cứu của luận văn, ngoài việc bổ sung riêng rẽ Polyvinylpyrolidone trong các môi trường nuôi cấy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng tổng hợp của chất Cysteine và Vitamin C đến khả năng chống nâu hóa chồi.
Việc kết hợp Cysteine có nồng độ từ 2 – 6 (mg/l) và Vitamin C từ 5 – 15 (mg/l) được tổng hợp trên bảng 3.6 cho thấy: Khi nồng độ Cysteine là 2mg/l và nồng độ Vitamin C lần lượt là 5, 10 và 15 (mg/l), tác dụng chống oxy hóa của 2 chất này thể hiện chưa rõ trong môi trường nuôi cấy mây nếp. Các chồi thu được chậm phát triển, phần gốc chồi màu vàng. Khi tăng nồng độ Cysteine lên 6mg/l kết hợp với Vitamin C từ 5 – 15 (mg/l) các chồi sinh trưởng chậm, điều này cho thấy các chất chống oxy hóa kể trên nếu bổ sung ở nồng độ cao có tác dụng ức chế sinh trưởng chồi mây. Khi nồng độ Cysteine là 4mg/l, kết hợp với Vitamin C có nồng độ từ 5 – 15 (mg/l), khả năng chống nâu hóa chồi tốt nhất trong các công thức thí nghiệm. Các chồi thu được rõ ràng, phát triển tốt, chồi có màu trắng ngà, xanh. Khi kết hợp giữa Cysteine (4 mg/l) và Vitamin C (10mg/l) tốt nhất cho khả năng chống nâu hóa chồi mây.
Hình 3.4. Cụm chồi mây trên môi trường nhân nhanh
A: Môi trường không bổ sung chất chống nâu hóa
B: Môi trường bổ sung Cysteine (4 mg/l) và Vitamin C (10mg/l)