Hình 3.9. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro loài Mây nếp
CÂY MẸ Chồi măng (Khử trùng mẫu: HgCl2 (0,1%) 8 phút + 4 phút) Phôi hạt (Khử trùng mẫu: NaOCl (60%) 10 phút) Cây mầm Tạo cụm chồi (MS* + 4 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin)
Kích thích tăng trưởng chồi
(MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l GA3)
Tạo cây hoàn chỉnh
(MS* + 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA)
Trồng và chăm sóc ngoài vườn ươm
(40% đất đồi + 60% cát vàng + 75% che sáng)
Nhân nhanh chồi
( MS* + 4 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin bổ sung 300 g/l Polyvinylpyrolidone hoặc 4 mg/l Cysteine + 10 mg/l Vitamin C)
1 tháng 1 tháng 1 tháng Cấy chuyển: 1 lần/tháng × 40 lần 4 - 6 (tháng) 18 tháng
QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI MÂY NẾP
1.Tạo mẫu sạch in vitro
- Tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt: Phôi hạt được làm sạch vỏ, khử trùng bằng NaOCl 60% trong 10 phút, sau đó rửa sạch và cấy vào môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Sau 2 tuần hạt nảy mầm thu được cây mầm đủ tiêu chuẩn cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi.
- Tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng: Chồi măng được khử trùng 2 lần bằng HgCl2 0,1 % ( lần 1: 8 phút; lần 2: 4 phút), sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 lần. Cấy vào môi trường MS cải tiến + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA.
2.Tạo cụm chồi in vitro
Sau 4 – 6 tháng cấy chuyển liên tục (1 tháng/lần), các chồi cấy ban đầu có cảm ứng tạo cụm chồi. Môi trường nuôi cấy tạo cụm chồi MS* + 4 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar.
3.Nhân nhanh chồi in vitro
Các cụm chồi thu được tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tạo cụm chồi, khi các cụm chồi có hiện tượng tạo ra các chồi có kích thước nhỏ li ti, chồi không rõ ràng, giảm hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng xuống còn 60% - 80%. Môi trường nuôi cấy nên bổ sung các chất chống oxy hóa Polyvinylpyrolidone (300mg/l) hoặc Cysteine (4mg/l) + Vitamin C (10mg/l).
Các cụm chồi mây có thể cấy chuyển 40 chu kỳ mà vẫn có hệ số nhân chồi cao.
4.Kích thích tăng trưởng chồi in vitro
Sau một số lần nhân nhanh, tùy theo mục đích sử dụng mà điều chỉnh số lần nhân nhanh. Sau đó cấy chuyển các cụm chồi tạo được sang môi trường kích thích tăng trưởng chồi 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l GA3.
5.Tạo rễ in vitro
Sau 1 tháng nuôi cấy trên môi trường kích thích tăng trưởng chồi, những chồi có chiều cao ≥ 4 cm, lá rõ ràng được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS* bổ sung thêm 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA + 8,0 g/l agar + 20 g/l đường saccharose.
Sau 1 tháng, cây ra rễ với tỷ lệ 100%, số rễ 2- 3 rễ/chồi, chiều cao ≥ 10 cm, cây khỏe mạnh, lá rõ ràng đủ tiêu chuẩn ra ngôi sẽ được đưa ra huấn luyện 10 – 15 ngày trước khi trồng ngoài vườn ươm.
6.Trồng và chăm sóc cây Mây nếp in vitro ngoài vườn ươm
-Cây đem cấy có chiều cao ≥ 10 cm, lá rõ ràng, đã qua huấn luyện 10 – 15 ngày, cây không cong queo sâu bệnh, không nấm bệnh.
-Cây cấy trên giá thể 40% đất đồi + 60% cát vàng ở chế độ che sáng 75%. Do thời gian nghiên cứu của luận văn còn nhiều hạn chế, chưa xác định được cây con đủ tiêu chuẩn xuất vườn, thông thường đối với các loài song mây, thời gian chăm sóc ngoài tối thiểu là 18 tháng mới đủ tiêu chuẩn trồng rừng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.KẾT LUẬN
1.1.Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt và chồi măng cây mây nếp
- Công thức khử trùng tốt nhất đối với hạt mây nếp là sử dụng chất khử trùng NaOCl ở nồng độ 60% trong thời gian 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch 78,79%.
- Công thức khử trùng tốt nhất đối với chồi măng mây nếp lấy từ thực địa là: khử trùng bằng dung dịch loãng HgCl2 0,1% lần 1 trong 8 phút, rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2
0,1% lần 2 trong 4 phút, rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần cho tỷ lệ mẫu sạch đạt được 75,1% và tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt 61,9%.