điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
Việc tạo được cụm chồi từ chồi của mây nếp trong điều kiện in vitro là dấu hiệu quyết định sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy. Các cụm chồi in vitro hình thành trong giai đoạn này sẽ là nguồn nguyên liệu cho các giai đoạn sau. Chồi in vitro được tạo ra không chỉ phụ thuộc vào trạng thái non trẻ của mẫu cấy, chất lượng mẫu cấy, loài cây mà còn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Khi mẫu cấy được tách rời đem nuôi trong các bình, ống nghiệm chúng sẽ không có khả năng tự dưỡng được, nếu chúng không được cung cấp các chất dinh dưỡng đầy đủ thì sẽ bị hoá nâu và dần dần sẽ chết. Vì vậy để các mẫu cấy có thể tồn tại, phân hoá và tiếp tục phát triển trong điều kiện in vitro, các mô, các cơ quan này cần được cung cấp các chất dinh dưỡng. Mặt khác, việc bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin và Cytokinin) vào môi trường sẽ làm tăng hiệu quả tạo cụm chồi in vitro cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chồi.
Theo các báo cáo đã công bố về nhân giống nhiều loài mây bằng nuôi cấy
in vitro cho thấy môi trường dinh dưỡng phù hợp để nuôi cấy chồi mây là MS nhưng tùy vào từng loài cụ thể mà dùng thành phần các chất đa lượng, vi lượng thay đổi cho thích hợp. Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng hiệu quả nhất trong giai đoạn tạo cụm chồi là BAP. Do đó, trên cơ sở các báo cáo công bố trên
thế giới và từ thực nghiệm nhân giống mây C. simplicifolius, chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng MS với thành phần khoáng đa lượng thay đổi và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp in vitro.
Theo các nghiên cứu ở các nước, như: Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, Singapo,... vật liệu dùng trong nhân giống in vitro được sử dụng trước tiên là phôi hạt. Từ nguồn mẫu sạch được tạo từ phôi hạt tiến hành nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh, nhân và kích thích tăng trưởng chồi. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được từ loại vật liệu nuôi cấy này, người ta mới tiến hành nuôi cấy các bộ phận sinh dưỡng (chồi măng, chóp rễ, mô lá...). Như vậy, việc nhân giống từ mẫu phôi hạt được coi là bước tối ưu hóa quy trình kỹ thuật nhân giống sinh dưỡng.
Hơn nữa, vì nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro sẽ cho phép sản xuất hàng loạt cây con từ mỗi phôi hạt của cây tốt được tuyển chọn, cho nên chỉ cần sử dụng một lượng rất ít cây mẹ tốt nhất để lấy vật liệu nhân giống.
Trong nội dung nghiên cứu này, vật liệu tiến hành các nghiên cứu là các cây in vitro nảy mầm từ phôi hạt, không bị nhiễm khuẩn, nấm. Kết quả cho thấy, sau một tháng nuôi cấy, tỷ lệ tạo cụm chồi trên tất cả công thức thí nghiệm là 0%. Kết quả này cũng phù hợp với các báo cáo đã công bố, nhiều tác giả cho biết đối với hầu hết các loài mây để tạo được cụm chồi từ mẫu sạch khởi đầu, chồi phải được cấy chuyển liên tục trên môi trường cảm ứng tạo cụm chồi (cấy chuyển khoảng 3 – 4 lần; nuôi 20 - 25 ngày thì cấy chuyển một lần).
Sau 3 lần cấy chuyển liên tục, một số chồi đã bắt đầu có dấu hiệu cảm ứng tạo cụm chồi ở hầu hết các công thức thí nghiệm. Các chồi này lại tiếp tục cấy chuyển sang môi trường mới. Sau 4 lần cấy chuyển, các cụm chồi đã hình thành rõ rệt, tiến hành thống kê và xử lý số liệu, kết quả thu được tổng hợp ở bảng 3.3. dưới đây:
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp
CTTN Môi trường
dinh dưỡng BAP (mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Số chồi TB/cụm Chất lượng chồi CC1 1MS 0 0,00 0,00 - CC2 1MS 1 26,67 2,25 + CC3 1MS 2 30,00 2,47 ++ CC4 1MS 3 27,69 2,22 ++ CC5 1MS 4 40,00 2,50 ++ CC6 1MS 5 37,50 3,00 + CC7 1MS 6 24,00 2,92 - CC8 1,5MS 0 0,00 0,00 - CC9 1,5MS 1 47,83 2,18 ++ CC10 1,5MS 2 46,30 2,40 ++ CC11 1,5MS 3 53,97 2,12 ++ CC12 1,5MS 4 62,50 2,56 ++ CC13 1,5MS 5 23,21 2,69 - CC14 1,5MS 6 20,00 4,22 - CC15 2MS 0 0,00 0,00 - CC16 2MS 1 50,00 2,60 ++ CC17 2MS 2 51,28 2,65 ++ CC18 2MS 3 66,67 2,34 ++ CC19 2MS 4 73,08 3,18 ++ CC20 2MS 5 55,56 2,67 ++ CC21 2MS 6 33,33 2,85 -
Ghi chú:+ : Chồi có chất lượng trung bình, chồi có màu xanh nhạt, thấp; ++: Chồi có chất lượng tốt, chồi có màu xanh đậm và vươn cao;
- : Chồi có chất lượng kém, chồi có màu xanh đậm nhưng nhiều chồi bị biến dị về hình thái (chồi cong keo).
ĐC: Môi trường cơ bản MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng.
Kết quả phân tích phương sai hai nhân tố cho thấy Ftính = 3,89 > F tra bảng = 2,99 (Phụ biểu 02) điều đó cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp.
Kết quả tổng hợp trên bảng 3.3 cho thấy: môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP các mẫu có cảm ứng tạo cụm chồi, tỷ lệ dao động từ 11,11% (thấp nhất) đến – 73,08% (cao nhất) và chất lượng chồi phân hóa thành 3 loại (chồi phát triển tốt, trung bình và kém). Chồi có chất lượng tốt (có triển vọng tái sinh thành cây) trên các công thức môi trường bổ sung từ 2,5 - 4,0 mg/l BAP. Trên môi trường 1MS, 1,5MS và 2MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng các mẫu cấy không có hiện tượng cảm ứng tạo cụm chồi, điều này cho thấy ảnh hưởng quyết định của BAP đến khả năng tạo cụm chồi mây nếp trong nuôi cấy in vitro.
Nhìn chung, ở mỗi loại môi trường dinh dưỡng khi tăng nồng độ BAP lên cao có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tạo cụm chồi:
- Trên thành phần môi trường dinh dưỡng 1 MS, khi bổ sung 2,0 - 4,0 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi tăng dần nhưng khi nông độ BAP > 4,0 mg/l tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi lại giảm dần. Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi thấp nhất là 11,11% ở nồng độ 2,0 mg/l BAP và cao nhất là 40% ở nồng độ 4,0 mg/l BAP. Số chồi trung bình/cụm ở công thức bổ sung 4,5 – 6,0 mg/l BAP là > 2,92 chồi/cụm nhưng chất lượng chồi kém (nhiều chồi bị biến dị không có khả năng tái sinh cây). Còn ở nồng độ 3,0 - 4,0 mg/l BAP số chồi trung bình/cụm > 2,22, chồi có chất lượng tốt
- Trên thành phần môi trường dinh dưỡng 1,5 MS, khi bổ sung 2,0 -4,5 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi tăng dần nhưng khi nồng độ BAP
> 5,0 mg/l tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi lại giảm dần. Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi thấp nhất là 30,23% ở nồng độ 2,0 mg/l BAP và cao nhất là 62,5% ở nồng độ 4,5 mg/l BAP, cao thứ 2 là 53,97% ở nồng độ 4,0 mg/l BAP. Số chồi trung bình/cụm ở công thức > 2,1 chồi/cụm, đạt cao nhất là 4, 22 chồi/cụm ở nồng độ 6,0 mg/l BAP nhưng hầu hết chồi bị biến dị về hình thái. Ở nồng độ 4,0 mg/l BAP số chồi trung bình/cụm là 2,12 thấp nhất trong 6 công thức nhưng chồi lại có chất lượng tốt nhất
- Tương tự như trên môi trường 1MS và 1,5 MS, trên thành phần môi trường dinh dưỡng 2 MS, khi bổ sung 2,0 - 4,0 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi tăng dần nhưng khi nông độ BAP > 4,0 mg/l tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi lại giảm dần. Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi thấp nhất là 24% ở nồng độ 2,0 mg/l BAP và cao nhất là 73,08% ở nồng độ 4,0 mg/l BAP. Số chồi trung bình/cụm ở công thức > 2,3 chồi/cụm, đạt cao nhất là 3,27 chồi/cụm ở nồng độ 6,0 mg/l BAP nhưng hầu hết chồi bị biến dị về hình thái và thấp nhất là 2,6 chồi/cụm ở công thức có nồng độ 2,5 mg/l BAP. Còn ở công thức có nồng độ 4,0 mg/l BAP số chồi trung bình/cụm đạt khá cao 3,18 chồi/cụm, chồi có chất lượng tốt nhất
Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng mẫu mây nếp cảm ứng tạo cụm chồi trên từng loại môi trường dinh dưỡng, nếu xét cả 2 chỉ tiêu số lượng và chất lượng chồi thì ở các công thức môi trường bổ sung 4 mg/l BAP cho kết quả tốt nhất.
Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến khả năng mẫu mây nếp cảm ứng tạo cụm chồi, cùng nồng độ BAP, môi trường dinh dưỡng 2 MS cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi cao hơn trên môi trường 1 MS và 1,5 MS.
Trong 21 công thức thí nghiệm trên, công thức 2 MS bổ sung 4,0 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi cao nhất 73,08% và trung bình 3,18 chồi/cụm, chồi có chất lượng tốt nhất.