Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp xác định vi khuẩn trong thịt tươi
2.3.4.1. Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi
Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi được quy định theo TCVN 7046:2009,
được thể hiện ở bảng 2.1:
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi (TCVN 7046 : 2009)
TT Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa
1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 g thịt 106 2 E. coli, số vi khuẩn trong 1 g thịt 102 3 Salmonella, số vi khuẩn trong 25 g thịt 0 4 Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1 g thịt 102
2.3.4.2. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt tươi
Xác định tổng số VKHK trong thịt tươi theo TCVN 5667:1992.
- Nguyên lý: Trên môi trường thạch thường, ở điều kiện hiếu khí, ở 370C, trong 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch chính là số vi khuẩn chứa trong mẫu phân tích.
- Chuẩn bị mẫu: Cân 25 g thịt (loại bỏ mỡ, gân, bạc nhạc) cho vào túi P.E chuyên dụng vô trùng, bổ sung thêm 225 ml dung dịch đệm Peptone. Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 1 phút. Hỗn dịch thu được có tỷ lệ mẫu pha loãng
10-1, từ mỗi dịch này có thể pha loãng 10-2, 10-3,… Tuỳ theo mức độ đánh giá ô nhiễm để xác định mức pha loãng.
- Phương pháp nuôi cấy: Với 1 mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm
độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch riêng. Lấy 1 ml dung dịch đồng nhất mẫu pha loãng ở những đậm độ khác nhau để chuyển vào đĩa Petri. Đổ vào mỗi đĩa 12 - 15 ml môi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hoà tan (đã được hấp vô khuẩn, để
nguội 450C), trộn đều bằng cách xoay nhẹđĩa 1 - 2 vòng theo chiều kim đồng hồ và ngược lại. Đểđĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm ngang, sau đó lật ngược
đĩa chuyển vào tủấm 370C, trong 24 giờđọc kết quả.
- Tính kết quả: Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch. Để tránh nhầm lẫn, đưa đĩa thạch lên giá kính chia ô đểđếm. Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc/đĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần được pha loãng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g thịt được tính theo công thức sau:
N = W W d C ) 1 . 0 ( 1+ 2 Trong đó:
N: Số khuẩn lạc trong 1 gam mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,0 nhân với 10w (W là chữ số mũ thích hợp của 10).
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
w1,w2: Sốđĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ 2. d: Hệ số của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất.
2.3.4.3. Phương pháp xác định vi khuẩn E. coli trong thịt tươi
Xác định vi khuẩn E. coli trong thịt tươi theo TCVN 5155:1990.
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 10 g thịt tươi (không lấy mỡ, gân, bạc nhạc) nghiền nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác 100 ml, bổ sung 90 ml dịch dinh dưỡng Nutrient Broth, được độ pha loãng 10-1. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút, tiếp tục pha loãng đến đậm độ không còn khả
năng dương tính (10-6, 10-7).
- Cấy dàn trên thạch MacConkey, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa thạch khác nhau, bồi dưỡng 370C/24h.
- Đếm số khuẩn lạc nghi E. coli (dạng S, bề mặt vồng, rìa gọn, tròn, màu đỏ
cánh sen, xung quanh có vùng mờ sương). Chỉ những đĩa thạch sau khi cấy 370C/24h (với 0,1 ml dịch nuôi cấy) có ít nhất 30 và không quá 300 khuẩn lạc mới
được chấp nhận. Tính kết quả theo Quinn P. J. và cs. (1994).
2.3.4.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi
Xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt tươi theo TCVN 5153:1990. Bao gồm các bước sau:
Bước 1 - Chuẩn bị, đồng nhất mẫu và tăng sinh lần 1: Cân 25 g thịt (không lấy mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền nhuyễn, cho vào bình tam giác 500 ml, bổ sung 225 ml dịch dinh dưỡng Nutrient broth, được nồng độ 10-1. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút. Để tủấm 37 0C /16 - 24h.
Bước 2 - Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất: Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu
đã đồng nhất theo bước 1, cấy vào 10 ml môi trường Selenite Broth, bồi dưỡng 43 0C /24h (ở nhiệt độ này Proteus spp. và nhiều vi khuẩn tạp nhiễm từ phân bịức chế không phát triển). Cấy trực tiếp canh khuẩn Selenite Broth 24h vào môi trường XLD agar, bồi dưỡng 37 0C /24h. Đọc kết quả: Salmonella phát triển mạnh, không lên men lactose, khuẩn lạc dạng S, màu đỏ, giữa có chấm đen, tròn (do sản sinh H2S).
Bước 3 - Đếm khuẩn lạc: Chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 x 1 -3µm, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di
động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum), bắt màu gram âm.
2.3.4.5. Phương pháp xác định vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt tươi
Xác định vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt tươi theo TCVN 5156:1990, cụ thể:
* Nguyên tắc
S. aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.
* Phương pháp
a/ Phân tích định tính S. aureus:
- Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn
- Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từống dương tính (môi trường chuyển từđỏ sang vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở
37oC trong 24 giờ.
- Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có tâm đen, trong suốt, đường kính 1 - 1,5 mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc.
- Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 370C 24 giờ. - Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương và ủở 370C trong 24 giờđể thử phản ứng đông kết.
- Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa là có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng thì không có).
b/ Định lượng S. aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: * Đồng nhất mẫu pha loãng:
Cân chính xác 10 ± 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc / đĩa.
* Phân lập trên môi trường chọn lọc:
- Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề
mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủở 37 ± 10C trong 24 - 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
- Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 - 1 mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh.
- Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục
ủ 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 - 1,5 mm, có màu
đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
- Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 - 2 µm. Hầu hết S.
aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
* Khẳng định:
- Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủở 37 ± 10C trong 24 giờ.
- Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc
đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độđông kết đều được xem là (+). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất nhưống không cấy.
* Cách tính kết quả:
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2) - Trong đó:
+ F: Là độ pha loãng
+ Nt: Tổng số khuẩn lạc đặc trưng
+ Na: Tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
+ Ht: Tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng
+ Ha: Tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng.