Ở Việt Nam cây ngải cứu được sử dụng rất sớm như một loại thuốc trong dân gian. Cao ngải cứu được sử dụng như một loại chất diệt và đuổi côn trùng, kháng đột biến và trừ giun. Ngoài ra nó còn được dùng để trị các bệnh ngoài da như viêm da, dị ứng trên da, ngứa và khô da. Nó cũng cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn gây ra các bệnh phụ khoa của cả phụ nữ và nam giới. Ngoài ra, dịch nước của cây ngải cứu cũng cho thấy khả năng điều trị các bệnh về xương khớp, chấn thương phần mềm, viêm cầu thận cấp, đục thủy tinh thể. Đặc biệt, ngải cứu được sử dụng rất nhiều trong việc điều trị các bệnh phụ khoa của phụ nữ như kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh… Một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia… cũng đã sử dụng dịch ngải cứu chữa bệnh từ rất lâu đời [50, 65].
Tuy nhiên, việc sử dụng ngải cứu làm thuốc mới chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian và một số đánh giá theo dịch chiết tổng hay tinh dầu của cây ngải cứu. Các hợp chất được chiết tách từ cây ngải cứu đã được các nhà khoa học thực hiện từ năm 1966 nhưng việc thử và đánh giá hoạt tính sinh học trên các chất sạch đã được tách ra từ cây ngải cứu hầu như chưa được tiến hành.
29
1.3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Năm 2011, các nhà khoa học Iran đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết các loài thực vật thuộc chi Artemisia trên 5 dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy với cây ngải cứu A. vulgaris, cặn chiết EtOAc có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với IC50 = 57 µg/mL, cặn chiết n-hexane có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa với IC50 = 153 và 160 µg/mL [66]. Theo Seema Gairola và các cộng sự cho thấy dịch chiết tinh dầu của cây ngải cứu có khả năngức chế sự phát triển của khối u xenograft tuyến tiền liệt, là cơ chế chống lại ung thư tuyến tiền liệt [67]. Một nghiên cứu của một nhóm các nhà khoa học Serbia đã công bố năm 2019 cho thấy chiết xuất của cây ngải cứu cho thấy khả năng gây độc với các tế bào ung thư đường ruột với chỉ số IC50 = 66,7 µg/mL và khả năng làm hoại tử các tế bào ung thư đạt 82,4 5% [68].
Các hợp chất sạch đã phân lập còn chưa được nghiên cứu nhiều về hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Trong các chất đã được công bố của các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã công bố thì hợp chất V82 được đánh giá có khả năng ức chế các tế bào PANC- 1 - một loại tế bào ung thư tuyến tụy với giá trị IC50 = 30,7 µg/mL [62]. Các hợp chất
V77-V81 mà các nhà nghiên cứu phân lập được cũng đã được đánh giá về khả năng ức chế monoamine oxidase - là loại enzym gây ra bệnh trầm cảm và bệnh Parkinson - với các giá trị IC50 trong khoảng 1,0 25,0 M [69].
1.3.3.2. Khả năng chống oxi hóa
Nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu cây ngải cứu cũng như dịch chiết của nó có hoạt tính chống oxi hóa cao. Trong nghiên cứu của Madhav kunal và cộng sự công bố năm 2018 cho thấycặn methanol có hoạt tính chống oxi hóa đạt 72,65%, trong khi tinh dầu đạt 88,65% [70]. Một nghiên cứu khác của Sunita Munda và cộng sự cho thấy tinh dầu có hoạt động chống oxy hóa với giá trị IC50 là 2,745 μg/mL [71]. Trong nghiên cứu của Bishnu Prasad Pandey và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol ức chế tương ứng 33,12, 43,47, 56,40, 68,27 và 82,80% ở nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 mg/mL, tinh dầu
A. vulgaris có hoạt tính với giá trị IC50 là 63,82 ± 0,0 mg/mL [72]. Theo Seema Gairola và các cộng sự, khả năng chống oxi hóa trong cây ngải cứu là do hàm lượng đáng kể của các chất flavonoid của cây [67]. Một nghiên cứu khác của D. Melguizo-Melguizo và cộng sự cho thấy dịch chiết của cây ngải cứu A. vulgaris có khả năng chống oxi hóa được giải thích do phần lớn hợp chất phenolic trong thành phần của nó [73].
30
1.3.3.3. Một số hoạt tính khác
Theo Nawar Aziz Alkhafaji và cộng sự cho thấy flavonoid được chiết xuất từ các bộ phận cành, lá và thân của A. vulgaris có tác dụng hạ đường huyết, từ đó dịch chiết cây ngải cứu được đề xuất cho khả năng chữa bệnh tiểu đường [74]. Trong một số nghiên cứu khác thì cho thấy chiết xuất methanol của các bộ phận trên mặt đất của cây ngải cứu - A. vulgaris có khả năng làm giảm tỷ lệ ấu trùng với phản ứng kháng thể giảm đáng kể trong giai đoạn phát triển của trichinellosis ở ruột và đường tiêm. Điều đó cho thấy cặn chiết methanol của A. vulgaris có thể là một loại thuốc thay thế chống lại bệnh trichinellosis – là nguyên nhân gây tiêu chảy, sốt, phù quanh hốc mắt và viêm cơ ở người [75, 76]. Một nghiên cứu khác về hoạt tính của cây ngải cứu từ các nhà khoa học Pakistan cho thấy A. vulgaris có tác dụng làm giãn cơ trơn, có thể qua trung gian thông qua sự kết hợp của cơ chế kháng cholinergic và đối kháng Ca2+, đây là cơ sở cho việc ứng dụng của cây ngải cứu trong hệ thống y tế truyền thống đối với các rối loạn đường ruột và đường hô hấp hiếu động, chẳng hạn như đau bụng, tiêu chảy và hen suyễn. Hơn nữa, các hoạt động chống tiêu chảy in vivo và giãn phế quản chứng minh hiệu quả của cây trong điều kiện như vậy và là một bước tiến trong việc khám phá đông dược [77]. Trong một nghiên cứu khác về tác dụng của cây ngải cứu với gan cho thấy A. vulgaris có khả năng hoạt động bảo vệ gan khi nhiễm độc gan cấp tính, điều đó được chứng minh bằng sự giảm cường độ của quá trình peroxid lipid và một độc tính của tetrachloromethane, làm cân bằng các chất sinh hóa, các chỉ số máu và gan đồng nhất với các thông số của gan khi không bị nhiễm độc [78]. Ngoài ra các nghiên cứu khác còn cho thấy dịch chiết từ cây ngải cứu có nhiều hoạt tính sinh học khác như khả năng chống sốt rét [79, 80], khả năng chống vô sinh [81], khả năng tăng/hạ huyết áp [82]…
31
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật
Mẫu cây đại bi - B. balsamifera được thu hái tại Vĩnh Phúc vào tháng 5 năm 2016 và được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (TPCN-22) được lưu tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
Cây đại bi - B. balsamifera
Mẫu cây ngải cứu - A. vulgaris L được thu hái tại Bắc Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 3 năm 2016 và được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (TPCN-07) được lưu tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
32
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): là phương pháp sắc ký tách hỗn hợp chất bằng cách cho pha động là chất lỏng di chuyển trên bề mặt pha tĩnh là chất rắn. Chất hấp phụ (hay pha tĩnh) được trải đều trên tấm kính (thường gọi là bản kính) hoặc tấm kim loại (thường dùng là nhôm và thường gọi là bản giấy). Trong quá trình chuyển động qua lớp chất hấp phụ, dựa vào sự hấp phụ khác nhau của các chất trong hỗn hợp cần phân tách với dung môi thích hợp ta thu được một sắc đồ trên lớp mỏng. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm (thường dùng ở bước sóng 254nm) hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulforic acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế: được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
- Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh, Merck). Silica gel pha đảo ODS (ODS-A, 12 nm S-150 m, YMC Co., Ltd.). Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Supelco).
- Sắc ký lỏng trung áp (MPLC): được thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng trung áp Biotage - Isolera One tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhằm phân tách các phân đoạn dịch chiết.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): được sử dụng để phân tích và tinh chế các hợp chất. Các thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống HPLC phân tích Agilent 1200 series và Hệ thống sắc ký lỏng điều chế Preparative HPLC-Agilent 1200 series tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
33
2.2.2. Các phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ khối lượng (ESI-MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization mass spectrometry) được đo trên máy AGILENT 1260 series single quadrupole LC/MS của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ NMR đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR và AVANCE III HD 500 của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY và ROESY.
+ Dung môi được sử dụng là CD3OD. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.
- Độ quay cực ([]D): Độ quay cực được đo trên máy Jasco P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ lưỡng sắc tròn (CD): quang phổ CD được ghi lại bằng máy đo quang phổ Chirascan (Applied Photophysics, Surrey, UK) của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào
2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
2.2.3.2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung
34
thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) và được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử được sàng lọc ở nồng độ 100 g/mL. Những chất có khả năng ức chế > 50% sự phát triển của tế bào tiếp tục được xác định giá trị IC50 ở các nồng độ 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL và 0.16 g/mL.
- Chất thử (20 L) pha trong DMSO 1% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL và 0.16 g/mL.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
35
[OD (chất thử) – OD (ngày 0)]
% sống sót = x100 OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)
% ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10; 2; 0,4; 0,08 g/mL. Giá trị IC50 của ellipticine luôn ổn định trong khoảng từ 0.25- 0.51 g/mL trên tất cả các dòng tế bào ung thư nghiên cứu.
- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 100 M (với hoạt chất tinh khiết) được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ cây đại bi – B. balsamifera
Mẫu đại bi – B. balsamifera sau khi thu hái về được phơi trong bóng râm rồi nghiền mịn thành bột thu được 2kg. Mẫu bột này được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 24h, sau đó được đem chiết không có siêu âm. Dịch chiết được rút ra và quay dưới áp suất giảm để loại hết dung môi và thu được phần cao chiết methanol. Quá trình này được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 lít methanol, để thu được 300 gam phần cặn chiết methanol.
Hình 2.1: Sơ đồ tạo dịch chiết mẫu cây đại bi
Blumea balsamifera
Bột khô 2kg (cành, lá, thân)
Cặn chiết methanol (300g) Chiết với methanol (3 lần x 5 lít)
Bổ sung nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, dichloromethane (3 lần x 2 lít cho mỗi loại dung môi)
Cặn n-hexane (39 g)
Cặn dichloromethane (45 g)
36
Cặn chiết methanol sau đó được hòa vào nước rồi đem chiết lần lượt với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane với mỗi loại dung môi được lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 lít, để thu được các cặn chiết: n-hexane ( 39 g),