Mẫu đại bi – B. balsamifera sau khi thu hái về được phơi trong bóng râm rồi nghiền mịn thành bột thu được 2kg. Mẫu bột này được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 24h, sau đó được đem chiết không có siêu âm. Dịch chiết được rút ra và quay dưới áp suất giảm để loại hết dung môi và thu được phần cao chiết methanol. Quá trình này được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 lít methanol, để thu được 300 gam phần cặn chiết methanol.
Hình 2.1: Sơ đồ tạo dịch chiết mẫu cây đại bi
Blumea balsamifera
Bột khô 2kg (cành, lá, thân)
Cặn chiết methanol (300g) Chiết với methanol (3 lần x 5 lít)
Bổ sung nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, dichloromethane (3 lần x 2 lít cho mỗi loại dung môi)
Cặn n-hexane (39 g)
Cặn dichloromethane (45 g)
36
Cặn chiết methanol sau đó được hòa vào nước rồi đem chiết lần lượt với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane với mỗi loại dung môi được lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 lít, để thu được các cặn chiết: n-hexane ( 39 g), dichloromethane (45 g), phần dịch nước và phần không tan.
Kiểm tra vết chất của các cặn chiết trên sắc ký bản mỏng silica gel, RP18 cho thấy các phần cặn dichloromethane và phần dịch nước đều có các vết tương đối đậm nét và rõ, còn phần cặn n-hexane các vết mờ và ít hơn. Vì vậy chủ động tiến hành phân lập các hợp chất từ phần cặn dichloromethane và phần dịch nước.
Phần dịch nước được lọc hết cặn không tan trước khi đưa lên cột diaion HP-20 và rửa giải trước tiên bằng nước để loại bỏ phần đường và muối vô cơ. Tiếp theo rửa giải bằng hệ dung môi gradien với các tỷ lệ methanol: nước lần lượt 50/50, 75/25 và 100% methanol thu được các phân đoạn W1(650mg), W2(8,7gam) và W3(16gam). Tiếp tục kiểm tra vết chất trên các phần phân đoạn vừa tách được cho thấy phân đoạn W1 có lượng ít và vết chất rất mờ, phần W3 tuy có lượng lớn nhưng vết chất không rõ ràng mà bị kéo thành vết dài không có khả năng tách được chất. Chỉ có phân đoạn W2 là các vết chất khá rõ ràng, đậm nét và có khả năng tách chất. Vì vậy chúng tôi sẽ tiến hành phân lập các hợp chất từ phân đoạn W2 của dịch nước.
Phân đoạn W2 (8,74g) được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP- 18 với dung môi methanol/nước: 1/4 1/2 thu được 6 phân đoạn chính từ W2A đến W2F. Phân đoạn W2B (756 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 7/1/0,055/1/0,1 thu được các phân đoạn W2B1 đến W2B8. Tiếp tục phân tách phân đoạn W2B5 (59 mg) bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và được rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/3 thu được hợp chất BB1 (6 mg). Phân đoạn W2D (2 gam) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,14/1/0,1 thu được các phân đoạn W2D1 đến W2D8. Tiếp tục phân tách phân đoạn W2D7 (177 mg) bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và được rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/2,5 thu được các phân đoạn W2D7A (36 mg) và W2D7B (54 mg). Phân đoạn W2D7A được phân tách tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/1 thu được 2 phân đoạn nhỏ hơn là W2D7A1 (16 mg) và W2D7A2 (5 mg). Tiếp tục
37
phân tách phân đoạn W2D7A1 bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và được rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/2 thu được hợp chất BB2 (7 mg). Phân đoạn W2C được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,14/1/0,1 thu được các phân đoạn W2C1 (110 mg); W2C2 (112 mg); W2C3 (222 mg); W2C4 (34,4 mg). Tiếp tục phân tách phân đoạn W2C1 bằng sắc ký cột sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/1 thu được các phân đoạn W2C1A(17,6 mg); W2C1B (52,8 mg) và W2C1C (11,1 mg). Còn phân đoạn W2C1B được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường và được rửa giải bằng dung môi dichloromethane/axeton = 2,5/1 thu được hợp chất BB7 (3 mg). Phân đoạn W2C3 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/axeton/nước với tỷ lệ 1/1,5/0,05 thu được các phân đoạn W2C3A (106 mg); W2C3B (15,9 mg); W2C3C (19,3 mg); W2C3D (15,5 mg) và W2C3E (24,8 mg). Phân đoạn W2C3A được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi ethylacetate /methanol/acid fomic với tỷ lệ 13/1/0,01 thu được các phân đoạn W2C3A1 (28 mg); W2C3A2 (30 mg) và W2C3A3 (11,7 mg). Phân đoạn W2C3A1 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,1 thu được chất BB4 (7 mg). Phân đoạn W2C3A3 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,1 thu được chất BB5 (2,2 mg). Phân đoạn W2F (591 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichloromethane/methanol với tỷ lệ 10/1 thu được các phân đoạn W2F1 đến W2F5. Phân đoạn W2F5 (43 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/1 thu được hợp chất BB6 (24 mg).
Phần cặn dichloromethane (45 gam) được lọc hết cặn không tan trước khi đưa lên cột silica gel pha thường và được phân cắt bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với các tỷ lệ lần lượt 100% dichloromethane; 50/1; 20/1; 10/1; 5/1; 2/1 và 100% methanol thu được các phân đoạn D1-D7. Trong các phân đoạn đã được tách ra cho thấy phân đoạn D3 có nhiều vết chất nhất nên chúng tôi tiến hành phân lập chất từ phân đoạn D3.
38
Phần phân đoạn D3 (9,89 gam) được đưa vào cột sắc ký silica gel pha thường và được phân cắt bằng hệ dung môi n-hexan/axeton với tỷ lệ lần lượt là 5/1; 3/1 và 1/1 được 3 phân đoạn D3A; D3B và D3C.
Phân đoạn D3B (3,27 gam) được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol/nước : 1/1 thu được các phân đoạn D3B1 đến D3B7. Phân đoạn D3B3 (280 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha thường và được rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol : 17/1 thu được các phân đoạn nhỏ hơn từ D3B3A đến D3B3D. Phân đoạn D3B3A (18 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường và được rửa giải bằng dung môi n-hexan/ethylacetate = 1/1,5 thu được phân đoạn D3B3A1. Phân đoạn D3B3A1 (11 mg) tiếp tục được phân giải bằng sắc ký cột sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/1 thu được hợp chất BB3 (2,4 mg).
Phân đoạn D3A (2,22 gam) được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol/nước : 1/1 thu được các phân đoạn D3A1 đến D3A4. Tiếp tục phân tách phân đoạn D3A1 (296 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha thường và được rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol : 30/1 thu được các phân đoạn nhỏ hơn từ D3A1A đến D3A1D. Phân đoạn D3A1C (24,6 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và được rửa giải bằng dung môi methanol/nước = 1/1 thu được các phân đoạn D3A1C1 đến D3A1C3.
Phân đoạn D3A1C3 (11 mg) tiếp tục đưa lên cột nhồi silica gel pha thường và rửa giải bằng dung môi n-hexan/ethylacetate = 1/1,5 thu được hợp chất BB8 (1,8 mg). Phân đoạn D3A1B (15 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH- 20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước : 1/1 thu được phân đoạn D3A1B1. Sau đó tiếp tục phân tách phân đoạn D3A1B1 bằng sắc ký cột silica gel pha thường và được rửa giải bằng dung môi n-hexan/axeton = 3/1 thu được D3A1B1.1, rồi tiếp tục đưa lên cột sắc ký pha đảo RP-18 và rửa giải bằng dung môi methanol/nước = 1,5/1 thu được hợp chất BB9 (3,7 mg).
39
Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây đại bi
W3 W2 Dianion HP 20 MW = 50/50, 75/25 và 100%M PR-18 MW 1/41/2 DMW 7/1/0,055/1/0,1 RP-18 MW 1/3 W2C W2C1 DMW 6/1/0,14/1/0,1 LH-20 MW 1/1 DA 2,5/1 W2D W2D7 W2D7A W2D7A1 BB2 (7 mg) W2E W2F W2F5 BB6 (24mg) W2C3 W2C3A W2C3A3 BB5 (2,2 mg) W2C3A1 BB4 (7 mg) W2C1B BB7 (3 mg) W2C1C W2B W2B5 BB1 (6 mg) W1 DAW 1/1,5/0,05 AM/.a.fomic 13/1/0,01 DMW 6/1/0,1 DMW 6/1/0,1 DMW 6/1/0,1 RP-18 MW 1/2,5 LH-20 MW 1/1 RP-18 MW 1/2 DM 10/1 LH-20 MW 1/1 Dịch nước cây đại bi
(W) D: dichloromethane M: methanol
H: hexan A: axeton W: nước E: ethyl acetate
40
Hình 2.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane cây đại bi Dịch chiết dichloromethane (D – 45g) Gradian DM: 100%D; 50/1; 20/1; 10/1; 5/1; 2/1; 100M D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D3A D3C HA: 5/1; 3/1; 1/1 YMC MW 1/1 D3A1 D3A1B D3A1C D3A1B1 D3A1C3 D3A1B1.1 BB8 (1,8mg) BB9 (3,7mg) DM 30/1 LH-20 MW 1/1 HA 1/1 RP-18 MW 1,5/1 RP-18 MW 1/1 HE 1/1,5 D3B D3B2 D3B3 D3B3A D3B3A1 BB3 (2,4mg) RP-18 MW 1/1 DM 17/1 HE 1/1,5 HL-20 MW 1/1 D: dichloromethane M: methanol H: hexan A: axeton W: nước E: ethyl acetate
41
Sau khi phân lập được 9 hợp chất từ các phần dịch chiết của cây đại bi chúng tôi thấy với số lượng chất đó đã đủ yêu cầu cho luận án nên chúng tôi dừng việc phân lập hợp chất ở tại phân đoạn D3 này.