* Phƣơng pháp xác định tỷ lệ nhiễm cầu trùng thỏ
Chúng tôi sử dụng phương pháp Fulleborn để xét nghiệm mẫu phân thỏ, xác định tỷ lệ nhiễm Oocyst cầu trùng.
Phương pháp Fulleborn: Sử dụng dung dịch nước muối NaCl bão hoà để
xét nghiệm phân, tìm Oocyst cầu trùng dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần (Phạm Văn Khuê và cs, (1996) [24])
* Phƣơng pháp xác định cƣờng độ nhiễm cầu trùng:
Xác định số lượng nang trứng cầu trùng trong 1 gam phân bằng buồng đếm Mc. Master.
- Cân 3 gam phân cho vào lọ thủy tinh. - Cho nước muối bão hòa tới vạch 45 ml. - Lắc và trộn đều cho phân tan hết.
- Lọc qua lưới lọc.
- Trộn đều và hút dung dịch cho lên 2 buồng đếm.
- Đếm số trứng trong 2 buồng đếm theo nguyên tắc đếm 2 cạnh. Cách tính:
+ Thể tích mỗi buồng đếm là 0,15 ml + Gọi số trứng đếm được là A
+ Số trứng trong tổng số 45ml là: 45 × A 0,15 + Số trứng có trong 1gam phân là: 45 × A
0,15 ×3
Phương pháp Mc. Master dùng để xác định cường độ nhiễm noãn nang cầu trùng.
Đếm số Oocyst cầu trùng trong 1g phân bằng buồng đếm Mc. Master và quy định theo các cường độ: nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng. Cường độ nhiễm được quy định như sau:
≤ 5.000 Oocyst/ gam phân: cường độ nhiễm nhẹ (+).
> 5.000 - 10.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm trung bình (++). > 10.000 - 15.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm nặng (+++). > 15.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm rất nặng (++++).
*Phƣơng pháp định loài cầu trùng
Việc định loài cầu trùng dựa vào kích thước, hình thái, cấu tạo của Oocyst
cầu trùng theo khoá định loài của Kolapxki N.A, P.I. Paskin (1980) [33].
* Phƣơng pháp xác định thời gian hình thành bào tử của Oocyst cầu trùng
Để xác định thời gian hình thành bào tử của Oocyst cầu trùng chúng tôi thu nhận Oocyst cầu trùng bằng cách lấy những mẫu phân thỏ nhiễm cầu trùng nặng, tiến hành phương pháp Darling. Sau lần ly tâm thứ hai, vớt
Oocyst cầu trùng ở phía trên cho vào ống ly tâm đã có sẵn nước lã, tiếp tục
quay ly tâm rồi gạn nước ở phía trên, thu Oocyst cầu trùng ở đáy ống ly tâm. Nuôi cấy Oocyst cầu trùng trong dung dịch Bichromat kali 2,5% để theo dõi thời gian phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh.
* Phân chia lứa tuổi thỏ.
Tuổi thỏ nghiên cứu được phân ra theo 6 lứa tuổi: - Thỏ 1 tháng tuổi. - Thỏ 2 tháng tuổi. - Thỏ 3 tháng tuổi. - Thỏ 4 tháng tuổi. - Thỏ từ 5 - 12 tháng tuổi. -Thỏ > 12 tháng tuổi.
* Tình trạng vệ sinh thú y trong chăn nuôi thỏ
Tình trạng vệ sinh thú y được đánh giá theo 3 mức độ:
- Tình trạng vệ sinh thú y tốt: chuồng trại cao ráo, thoáng mát, sạch sẽ. Đáy lồng chuồng phải nhẵn, phẳng, có khe hở, rãnh thoát phân nước tiểu dễ
dàng, ít thấm nước và tháo ra lắp vào được. Chuồng được cọ rửa và dọn phân thường xuyên, không có hiện tượng tồn phân quá 1 ngày. Thức ăn, nước uống đảm bảo đủ và sạch sẽ, máng ăn, máng uống phải thường xuyên cọ rửa. Rau xanh được rửa sạch, để khô trước khi cho thỏ ăn. Định kỳ khử trùng tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi.
- Tình trạng vệ sinh thú y trung bình: lồng chuồng được làm bằng nhiều vật liệu khác nhau như gỗ, sắt… song không thường xuyên dọn phân, có hiện tượng tồn phân quá 2 ngày trong chuồng. Mỗi tuần cọ rửa máng ăn, máng uống 1-2 lần.
- Tình trạng vệ sinh thú y kém: đáy lồng chuồng ẩm thấp, không có rãnh thoát nước tiểu, phân, không cọ rửa chuồng và dọn phân, có hiện tượng tồn phân trong chuồng một vài tuần. Máng ăn, máng uống không được cọ rửa.
* Mùa vụ:
Chúng tôi thực hiện đề tài trong thời gian 1 năm (từ tháng 10/2009 - 10/2010) và phân thành hai mùa vụ:
- Vụ Xuân - Hè: Từ tháng 02 - tháng 08.
- Vụ Thu- Đông: Từ tháng 09 năm trước - tháng 01 năm sau.
* Phƣơng pháp theo dõi các biểu hiện lâm sàng của thỏ bị bệnh cầu trùng
Biểu hiện lâm sàng được xác định ở những thỏ mà kết quả xét nghiệm phân là nhiễm cầu trùng ở mức độ nặng và rất nặng. Phương pháp chủ yếu là quan sát những biểu hiện của thỏ: thể trạng, niêm mạc, trạng thái phân…
* Phƣơng pháp xác định bệnh tích đại thể
Mổ khám những thỏ bị bệnh cầu trùng ở mức độ rất nặng (có biểu hiện lâm sàng của bệnh cầu trùng), quan sát bằng mắt thường và kính lúp các phần của ruột non, ruột già, gan. Chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình.
* Phƣơng pháp xác định những biến đổi bệnh lý vi thể ở một số cơ quan do cầu trùng gây ra
phẩm được gửi về Trung tâm Chẩn đoàn Thú y Quốc gia làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc parafin. Mỗi bệnh phẩm đúc 4 block và mỗi block chọn 5 tiêu bản cắt mỏng, nhuộm Hematoxilin - Eosin (H.E). Đọc kết quả bằng kính hiển vi quang học có độ phóng đại tối đa là 1.500 lần.
- Quy trình làm tiêu bản vi thể được tiến hành như sau:
+ Lấy bệnh phẩm: cắt phần bệnh phẩm có nhiều tổn thương do cầu trùng + Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch formol 10%.
+ Rửa nước 12 - 24 giờ (rửa dưới dòng nước chảy nhẹ) để trôi hết formol. + Khử nước: dùng cồn tuyệt đối để rút nước từ bệnh phẩm ra.
+ Làm trong tiêu bản: ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm.
+ Tẩm parafin: ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đựng parafin nóng chảy, để ở tủ ấm nhiệt độ 500C.
+ Đổ Block: rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: cắt bệnh phẩm trên máy cắt Microcom, độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng 1 phần, glyxerin 1 phần, 1ml hỗn hợp trên pha trong 19ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - eosin.
+ Gắn lamen bằng Bom canada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi.
*Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh cầu trùng thỏ.
Chúng tôi căn cứ vào kết quả xét nghiệm phân và những biểu hiện lâm sàng của thỏ để dùng thuốc điều trị cầu trùng.
Những thỏ bị nhiễm cầu trùng ở mức độ nặng và rất nặng chia thành 6 nhóm điều trị với 3 loại thuốc khác nhau. Thí nghiệm được thực hiện với phác
Phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh cầu trùng thỏ Lô thí
nghiệm
Số thỏ thí
nghiệm Loại thuốc/ liều lƣợng/ liệu trình
Nhóm 1 14 Phar- Coccitop 1g/3,3kg TT; liệu trình 4-3-4 Nhóm 2 14 Phar- Coccitop 1g/1,6kg TT; liệu trình 5-3-5 Nhóm 3 12 Vimecox - SPE3/ 8kgTT; liệu trình 4-3-4 Nhóm 4 12 Vimecox - SPE31g/ 4kgTT; liệu trình 5-3-5
Nhóm 5 14 Marcoc 1g/6kg TT; liệu trình 4-3-4 Nhóm 6 14 Marcoc 1g/3kg TT; liệu trình 5-3-5
Sau khi cho thỏ sử dụng thuốc 5-10 ngày, xét nghiệm lại phân của những thỏ đã được dùng thuốc. Nếu không tìm thấy Oocyst trong phân thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để. Nếu vẫn thấy Oocyst trong phân nhưng số lượng Oocyst /g phân giảm rõ rệt thì xác định thuốc có hiệu lực nhưng chưa triệt để. Nếu thấy số lượng Oocyst /g phân vẫn không giảm so với trước khi dùng thuốc hoặc giảm không đáng kể thì xác định thuốc không có hiệu lực.
-Xác định độ an toàn của thuốc điều trị bệnh cầu trùng: Độ an toàn của thuốc được đánh giá bằng kết quả theo dõi trạng thái cơ thể, sự vận động, ăn uống của thỏ trước dùng thuốc 1 giờ và sau dùng thuốc 3 giờ.
* Đề xuất biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh cầu trùng thỏ.
Dựa trên đặc điểm dịch tễ và kết quả thử nghiệm sử dụng thuốc điều trị cầu trùng cho thỏ để đề xuất biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh cầu trùng.