Khả năng bền vững của chất kháng nấm với pH là một đặc điểm đáng chú ý vì điều này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ tách chiết mà còn có ý nghĩa t rong ứng du ̣ng . Để xác đi ̣nh khả năng bền với pH của chất kháng nấm , dịch kháng nấm thô được điều chỉnh về các pH 3 ÷ 9 và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7. Hoạt chất kháng nấm của di ̣ch chiết được x ác định bằng phương pháp đục lỗ .Kết quả được thể hiện trên hình 3.14 và hình 3.15.
Hình 3.15. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm
Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c,d) G. Candidum
Kết quả trên Hình 3.14 và hình 3.15 cho thấy, dịch kháng nấm của chủng R 12-4 vẫn giữ được hoa ̣t tính ở trong dải pH 3 ÷ 9 trong thời gian 60 phút đã chứng tỏ : các chất kháng nấm này đều có khả năng bền với pH . Dịch chiết kháng nấm có hoa ̣t lực ma ̣nh nhất ở pH7, hơi giảm dần trong các môi trường axit và kiềm .Tuy nhiên , mức độ giảm không nhiều.Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chất kháng nấm từ chủng R12-4 thuộc loại bền với pH. Đây là một đặc điểm rất lợi thế trong công nghiệp thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng thời mở rộng khả năng ứng dụng của chất kháng sinh này
3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng nấm 0 5 10 15 20 25 Hoạt tính kháng nấm (D, mm) 3 4 5 6 7 8 9 7,3 (ĐC) pH thử nghiệm F. oxysporm Geotrichum candidum
Hình 3.14. Độ bền của chất kháng nấm với
pH
a
b
Chất kháng nấm thô được tách chiết từ sinh khối hoặc dịch nuôi cấy được tiến hành tinh sạch theo quy trình mục 2.2.5, phần vật liệu và phương pháp, thu được kháng nấm tinh sạch. Kiểm tra hoạt tính kháng nấm của kháng sinh tinh sạch thu được cho thấy kháng sinh vẫn giữ nguyên được khả năng kháng vi sinh vật kiểm định ban đầu.
a b c
Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c) G. candidum
Hình 3. 16. Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch
Hình 3. 17. Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch Trên phổ UV đo trong dung môi methanol xuất hiện 3 đỉnh cực đại hấp thụ ở bước sóng 322; 338 và 357nm, phổ khá gọn và sắc nét chứng tỏ mẫu kháng sinh đem phân tích là tinh sạch.
Hình 3.18. Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch Trên phổ IR xuất hiện các dao động đặc trưng của các liên kết (cm-1
): Trên Phổ IR xuất hiện dao động dặc trưng của các liên kết (cm-1
): 3313(-OH); 2943; 2831(CH bão hòa); 1448; 1413 (biến dạng CH); 1020(C-O). Qua phổ IR dự đoán chất kháng nấm củ chúng tôi có chứa nhiều nhóm OH liên kết với C.
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Từ 20 mẫu rễ, cành cây cam thu thập ở Hàm Yên – Tuyên Quang, đã phân lập được 40 chủng xạ khuẩn. Số lượng xạ khuẩn thu được trên mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu cành (rễ 62,5%, cành 37,5%). Trên môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng với 7 màu tương ứng trong đó, nhóm trắng chiếm tỷ lệ cao nhất (81,44%), nhóm vàng cam chiếm 11,91%, nhóm xám 2,59% nhóm xanh rêu 0,65 và nhóm nâu 1,57, vàng 1,39 và đen 0,46%.
2. Trong số 40 chủng phân lập được có: 30% xạ khuẩn kháng vi khuẩn
Staphylococcus aureus, 12,5% kháng P.aeruginosa, 2,5% kháng B.subtilis. Đối với các chủng nấm kiểm định, có 30% xạ khuẩn nội sinh phân lập được đối kháng với
G.candidumvà Colletotrichum,12,5% kháng F. udum, F. oxysporum
3. Đã lựa chọn được 2 chủng R12-4 và C12 có hoạt tính kháng nấm cao để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại cho kết quả 2 chủng đều thuộc chi
Streptomyces. Dựa trên phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rRNA chủng C12thuộc loàiS. angustmyceticus, được định danh làS. angustmyceticus C12 và chủng R12-4 thuộc loàiStreptomycesprasinopilosus, được định danh làS. prasinopilosus R12-4
4. Đã nghiên cứu được môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ khuẩn nội sinh R12-4 và C12: hoạt chất kháng nấm được sinh tổng hợp tốt nhất trên môi trường AH4, 28 ÷ 30°C, pH 7,0.
5. Đã nghiên cứu tách chiết sơ bộ hoạt chất kháng nấm từ chủng R12-4: chiết chất kháng nấm từ sinh khối của chủng R12-4 bằng dung môi methanol ở pH 7,0. Tách chiết từ dịch lên men bằng dung môi ethyl acetate ở pH 7,0.
6. Đã kiểm tra được tính chất hóa lý của chất kháng nấm từ chủng R12-4: chất kháng nấm bền ở nhiệt độ dưới 80°C và trong khoảng pH 5 ÷ 9.
7. Đã thu được sản phẩm có hoạt tính kháng nấm tinh sạch. Chất kháng nấm được phân tích bằng phổ UV VIS và phổ hồng ngoại.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc hoá học của chất kháng nấm thu nhận từ chủng xạ khuẩn S. angustmyceticus C12và S. prasinopilosus R12-4.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh ho ̣c , 2006,
2. Cao Ngọc Điệp, Phan Thị Nhã (2011), Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây Khóm (Ananas comosus [L.]) trồng trên đất phèn thị xã vị thanh, tỉnh Hậu Giang, Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(2): 243-250. 3. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng
sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội.
4. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Việt Nam.
5. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai Ngọc Toàn (2005), Chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm
Aspergillus awamori Nakazawa kí sinh trên cây sảng Sterculia lanceolata
Car họ Sterculiaceae, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 43 (6A): 132-136 6. Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997), Phân lập nghiên cứu các chất chiết từ
nấm nội kí sinh trong cây Taxus chinensis, Kỷ yếu-Annual report, Viện Hóa Học.
7. Lương Thị Hồng Hiệp, Cao Ngọc Điệp (2011), Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyên chi (Twedelia trilobata (L.) hitche.) bằng kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học, 18a: 168-176
8. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr. 53 – 71.
9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (2007) vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
10.Nguyễn Sỹ Giao (1971), Nghiên cứu định hướng ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong môi trường cây non phục vụ nghề trồng rừng, Tập san lâm nghiệp (4): 23-28
11.Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học sư Phạm Hà Nội.
12.Nguyễn Thi ̣ Thu Thuỷ , Hoàng Thị Kim Hồng (2009): Nghiên c ứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa màu ở Thừa Thiên Huế. Hội nghị CNSH toàn quốc 2009.
13.Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội.
14.Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây cao su có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola, Tạp chí Sinh học, 36(1se): 173-179.
Tiếng Anh
15.Alipour H., Hosein B. A., Jahed M., Rahnama H., Sharifnia M., (2013). A Review on Citrus Production and Export Marketing Strategies in Mazandaran Province Iran, Middle-East Journal of Scientific Research, 14 (10): 1375-1380
16.Bacon C.W. and White J.F., 2000. Microbial Endophytes. Marcel Dekker, New York, pp: 341-388
17.Cao L.X., Qiu Z.Q., You J.L., Tan H.M., Zhou S. (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium with phathogen from surface-sterilized banana roots. FEMS Microbiol Lett 247: 147-152 18.Conn V.M. and Franco C.M.M. (2004). Analysis of the endophytic actinobacterial population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones. Appl Environ Microbiol, 70: 1787-1794.
19.Conn V.M., Walker A. R., Franco C.M.M (2008), Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Microbe Interact, 21 (2): 208-218.
20.Coombs J.T. and Franco C.M.M. (2003). Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat root. Appl Environ Microbiol, 69:5603-5608.
21.De Aráujo J M , da Silva A C and Azevedo J L (2000) Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of maize (Zea mays L.). Brazilian Archvies of Biology and Technology 43: 447-451 .
22.El-Tarabily, K. A. & Sivasithamparam, K. Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Soil Biol. Biochem. 38, 15.
23.Gangwar M, S. Dogra, N Sharma (2011), Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plans, J Advanced Lab Research in Biology 2(4): 154-157.
24.Gangwar M., Dogra S., Gupta U. P., Kharwar R. N. (2014). Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, African Journal of Microbiology Research, 8(2): 184-191.
25.Hong Y.Z., Quan H.X., Ming T., Guang H.S. (2013), Effect of actinomycetes on ginseng growth and production of ginsenosides, J Food Agr Environ 11(1): 557- 559.
26.Igarashi Y. (2004).Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes. Actinomycetologica 18:63–66
27.Inderiati S. and Muliani S. (2008). Isolation and characterization of endophytic actinomycetes of tobacco plants. Journal of Agrisistem 4: 82-100.
28.Intra B., Mungsuntisuk I., Nihira T., Igarashi Y., Panbangred W. (2011). Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease. BMC Research Notes, 4:98.
29.Kandpal K. C., Jain D. A., Kumar U., Tripathi R., Kumar T. S. (2012). Isolation and screening of endophytic actinomycetes producing antibacterial compound from Citrus aurantifolia Fruit, European Journal of Experimental Biology, 2 (5):1733- 1737.
30.Keswani J., Whitman W. B. (2001). Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51, 667–678.
31.Lee S. O., Choi G. J., Jang K. S., Park D-J., Kim C-J.and Kim J-C. (2008). Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chinese cabbage roots as antagonists to Plasmodiophora brassicae. 18 1741-1746
32.Lee. J.Y. and Hwang, B.K. (2002). Diversity of antifungal actinom ycetes in various vegetative soils of Korea. Canadian J. Microbiol., 48:407–417
33.Malfanova N., Lugtenberg B., and Berg G. (2013). Chapter 2, in “Molecular microbial ecology of the rhizosphere”, de Bruijn FJ (ed), Wiley-Blackwell. 34.Mini Priya R. (2012). Endophytic Actinomycetes from Indian Medicinal
Plants as Antagonists to Some Phytopathogenic Fungi, Open Access Scientific Reports, 1(4):1-5.
35.Nimnoi P., Pongsilp N., Lumyong S. (2010), Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth promoters production. World J Microbiol Biotechnol, 26:193–203.
36.Nomomura H. (1974). Key for Classification and Identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP, J. Ferment. Technol., 52(2): 78-92
37.Petrini, O. (1991). Fungal endophytes of tree leaves. In: Microbial ecology of the leaves (eds. N.J. Fokkema and 1. van den Heuvel). Cambridge University Press, Cambridge: 185- 187.
38.Qin S., Zhao G.Z., Li J., Zhu W.Y., Xu L.H., Li W.J.(2009) Actinomadura flavalba
sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis. int J Syst Evol Microbiol., 59(10):2453-2457.
39.Qin S., Xing K., Jiang J. H., Xu L. H., Li W. J. (2011). Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (3): 457-473.
40.Sambrook J., Russell D. W. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
41.Sardi P., Saracchi M., Quaroni S., Petrolini B., Borgonovi E. and Merlit S. (1992).Isolation of endophytic Streptomyces strains from surface-sterilized roots. Applied and Environmental Microbiology 58: 2691-2693
42.Sarma C., Borthakur A., Singh S., Modi M. K., Sen P. (2011), Efficient in vitro plant regeneration from cotyledonary explants of Citrus reticulata L. Blanco. Annals of Biological Research, 2 (6):341-348.
43.Shimizu M. (2011), Endophytic Actinomycetes: Biocontrol Agents and Growth Promoters, in Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses, Chap. 10, Ed. Maheshwari D.K., Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2011 44.Shirling E. B., Gottlieb D. (1966). Cooperative description of type culture of
Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 19(4): 391-512
45.Shutsrirung A., Chromkaew Y., Pathom-Aree W., Choonluchanon S., Boonkerd N. (2013), Diversity of endophytic actinomycetes in mandarin grown in northern Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting activity. Soil Science and Plant Nutrition, 59 (3):322- 330.
46.Snoussi H., Duval M-F., Garcia-Lor A., Belfalah Z., Froelicher Y., Risterucci A-M., Perrier X., Jacquemoud-Collet J-P., Navarro L., Harrabi M., Ollitrault P. (2012), Assessment of the genetic diversity of the Tunisian citrus rootstock germplasm, BMC Genetics, 13:16.
47.Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004), Natural products from endophytic microgranisms, J. Nat. Prod. 67: 257-268.
48.Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b) Antitumor activity of 4- arylcoumarins from endophytic Streptomyces aur- eofaciens CMUAc130. J Cancer Res Trer 3:86–91.
49.Taechowisan T., C. Lu, Y. Shen and S. Lumyong (2005), Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity Microbiology 151, 1691–1695.
50.Taechowisan T., Chanaphat S., Ruensamran W., Phutdhawong W. S. (2014), Antibacterial activity of new flavonoids from Streptomyces sp. BT01 an endophyte in Boesenbergia rotunda (L.) Mansf.,Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(4): 8-13.
51.Takahashi Y & Omura S (2003) Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds. Journal of General & Applied Microbiology 49: 141-154
52.Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006) Isolation of endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their activities against
Ralstonia solanacearum in vitro. World J Microbiol Biotechnol 22:1275–1280. 53.Tokala R. K., Strap J. L.,Jung C. M., Crawford D. L.,Salove M. H., Deobald
L. A.,Bailey J. F., Morra M. J. (2002). Novel plant microbe Rhizosphere interaction involving Streptomyces lydicus WYEC108 and the Pea Plant (Pisum sativum), Appl Environ Microbiol, 68 (5):2161–2171.
54.Trerner H.D., Buckus E.J. (1963). System of color wheels for Streptomycete
taxonomy, Appl Microbiol 11: 335 – 338.
55.Verma V. C., Gond S. K, Kumar A., Mishra A., Kharwar R. N. and Gange A. C. (2009). Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A. Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity. Microbial Ecology 57: 749.
56.Waksman S.A. (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 2. 57.Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M. H., Sneath P.H.A., Sackin M.J. (1983). Numerical classification of Streptomyces and related genera, J. Gen. Microbiol., 129: 1743–1813.
58.Xu Z. H., Gao D. M. , Song X. L., Xu. (2012). A review of endophyte and its use and function. International Conference on Environmental Engineering and Technology Advances in Biomedical Engineering, 8:124–130.
59.Zhao P.J., Fan L.M., Li G.H., Zhu N., Shen Y.M. (2005). Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp. Is9131. Arch Pharm Res 28:1228 – 1232.
PHỤ LỤC Phụ lục 1
Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GenBank: KT717957.1 FASTA Graphics Go to:
LOCUS KT717957 1407 bp DNA linear BCT 26-OCT-2015 DEFINITION Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.
ACCESSION KT717957
VERSION KT717957.1 GI:940414451 KEYWORDS .
SOURCE Streptomyces angustmyceticus ORGANISM Streptomyces angustmyceticus
Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1407)
AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Thao,P.T.H.
TITLE Endogenous actinomycetes isolation from the king mandarin of Tuyen Quang
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 1407)
AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Thao,P.T.H. TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (04-SEP-2015) Soil Microbiology, Institute of
Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Ha Noi, Cau Giay, Viet Nam
FEATURES Location/Qualifiers source 1..1407 /organism="Streptomyces angustmyceticus" /mol_type="genomic DNA" /strain="C12" /db_xref="taxon:285578" /country="Viet Nam" rRNA<1..>1407
/product="16S ribosomal RNA" ORIGIN
1 ggggggctac catgcagtcg acgatgaacc tccttcggga ggggattagt ggcgaacggg 61 tgagtaacac gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa 121 taccggatac gacctccgac cgcatggtct ggtggtggaa agctccggcg gtgaaggatg 181 agcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc 241 cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 301 gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg 361 atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgagagt gacggtacct 421 gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg 481 ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggct tgtcacgtcg gatgtgaaag 541 cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga tacgggcagg ctagagttcg gtaggggaga 601 tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag
661 gcggatctct gggccgatac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 721 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgtt gggaactagg tgtgggcgac attccacgtc 781 gtccgtgccg cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa 841 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcagcggagc atgtggctta attcgacgca 901 acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata caccggaaaa ccctggagac agggtccccc 961 ttgtggtcgg tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1021 taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc tgtgttgcca gcatgccctt cggggtgatg 1081 gggactcaca ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1141 catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaat gagctgcgat 1201 accgcgaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc 1261 gaccccatga agtcggagtt gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt 1321 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg 1381 gcccaacccc ttgtggagga atcgtcg//
Phụ lục 2
Streptomyces prasinopilosus strain R12-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GenBank: KT751524.1 FASTA Graphics Go to: