- Khả năng sử dụng nguồn cacbon
Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon, nito nhằm đánh giá đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn, bên cạnh đó giúp định hướng tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men. Khả năng này được đánh giá thông qua sự phát triển trên môi trường ISP9, trong đó nguồn cacbon được thay thế bởi các loại đường quy định trong khóa phân loại. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn được trình bày dưới bảng 3.7.
(1) (2)
Hình 3.9. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn (1) R12-4, (2) C12 sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C
Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C
Nguồn cacbon(1,0 %, w/v) Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn
R12-4 C12
D-glucose ++ ++
D-sucrose ± ++ D- xylose ++ ++ D-manitolse ++ ++ D- fructose ++ ++ D-cellulose ++ ++ D-rafinose - ++ D-rhamnose ± ± Đối chứng
Ghi chú: ++: sinh trưởng tốt; +: sinh trưởng trung bình; “±”: sinh trưởng yếu; : không sinh trưởng.
Xạ khuẩn nội sinh C12 có khả năng đồng hóa tất cả 9 nguồn đường cơ bản: D- alucose, L-arabinose, D-sucrose, D-xylose, D-manitolse, D-fructose, D-cellulose, D-rafinose, D-rhamnose. Xạ khuẩn TQR12-4 có khả năng đồng hóa được D- glucose, L-arabinose, D-sucrose, D-xylose, D-manitolse, D-fructose, D-cellulose, D-rhamnose, đồng hóa yếu L-arabinose, D-sucrose, D-rhamnose và không đồng hóa được D-raffinose.
- Ảnh hƣởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng phát triển của xạ khuẩn
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của phản ứng hóa học, các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, pH và khả năng chịu NaCl của mỗi tế bào. Đối với các cơ thể đơn bào như xạ khuẩn, nhiệt độ có tác động trực tiếp đến các hoạt động sinh lý của tế bào.Mặt khác khả năng chịu được nồng độ NaCl, pH và khoảng nhiệt độ sinh trưởng cũng là một trong những đặc điểm sinh lí - sinh hóa quan trọng của chủng vi sinh vật. Sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường Bennett ở các điều kiện thí nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ được thể hiện trong bảng 3.8, 3.9 và 3.10.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Kí hiệu
chủng Khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trường có sự thay đổi của nồng độ NaCl (%)
0 1 2 3 5 7
R12-4 +++ +++ +++ ++ - -
C12 +++ +++ +++ ++ + -
Chủng C12 có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 0 ÷ 5(%),chủng R12-4sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ muối 0 ÷ 3(%).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Kí hiệu chủng
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
R12-4 - - + + ++ +++ +++ ++ + - -
C12 - - - + ++ +++ +++ ++ + - -
Chủng R12-4 có thể sinh trưởng tốt ở pH 4÷10, chủng C12 có thể phát triển tốt ở pH 5÷10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Kí hiệu chủng xạ khuẩn
Khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trường ở các nhiệt độ khác nhau (o
C)
10 20 25 30 37 40 45
R12-4 - ++ +++ +++ ++ + -
C12 - ++ +++ +++ ++ + -
Ghi chú: “-” Không sinh trưởng, “+” sinh trưởng bình thường, “++ sinh trưởng tốt”, “+++” sinh trưởng rất tốt.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng xạ khuẩn đều có thể sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ từ 20 ÷ 40oC, có thể kết luận chủng thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic). Hai chủng xạ khuẩn này phát triển được trên môi trường có dải pH khá rộng, phát triển tốt nhất ở pH 7 ÷ 8.
-Khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào
Khả năng sinh enzyme ngoại bào là một trong những đặc điểm cho biết sự thích nghi của xạ khuẩn đối với môi trường sống.Trong thí nghiệmnày, khả năng sinh tổng hợp một số nhóm enzyme như: cellulose; amylase; protease; chitosanase; ligninase của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
Bảng 3.11. Khả năng phân giảimột số cơ chất của các hai xạ khuẩn lựa chọn Cơ chất đặc hiệu Đường kính vòng phân giải (D-d mm)
R12-4 C12 Tinh bột 25 20 Casein 23 21 CMC 31 28 Chitin 21 23 Guiacol 25 20
Hai chủng xạ khuẩn nội sinh nghiên cứu có hệ enzyme ngoại bào phong phú (cellulase, amylase, protease, xylanase, chitinase).
Tách ADN tổng số và khuếch đại gen 16S rDNA của hai xạ khuẩn nghiên cứu
DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn được tách chiết theophần vật liệu phương pháp. Kết quả điện di kiểm tra AND tổng số trên gel agarose được trình bày trên hình 3.10. và 3.11
Hình 3.10.Điện di đồ DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel agarose 1,0 %
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0% (Trong đó Lane 1 là sản phẩn PCR của chủng C12 và Lane 2 là sản phẩm PCR của chủng R12-4. M (thang chủng): Macker Hyper ladder 1kb (Cat. No. Bio-33053)
Kết quả trên hình 3.10 cho thấy, quá trình tách chiết ADN tổng số của hai chủng xạ khuẩncho kết quả tốt, ADN tổng số thu được có băng gọn. ADN tổng số của các chủng này được xử lý với RNase và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA từ ADN tổng số của hai chủng xạ khuẩn với cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492Rcho một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 1,4 kb (hình 3.11). Kết quả trên cho thấy phản ứng PCR trong thí nghiệm này là đặc hiệu.
- Giải trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 và phân loại
Nhằm định tên chủng C12 đến loài, bên cạnh các kết quả về đặc điểm sinh hóa, cần kết hợp thêm trình tự gen 16S rRNA.So sánh trình tự gen 16S rRNA của xạ khuẩn nội sinh C12với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn nghiên cứu có độ tương đồng cao với các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Streptomyces sp như: S. angustmyceticus (KM370068); S. prasinopilosus (99%). Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, xạ khuẩn nội sinh C12 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với loài S. angustmyceticus nên chủng xạ khuẩn này được đặt tên là S. angustmyceticus C12,và được đăng ký trên ngân hàng Genbank(Phụ lục 1).
Hình 3.12.Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA
Bảng 3.12.Mức độ tương đồng của gen mã hóa 16S rRNA chủng R12-4 với trình tự của các chủng trên GenBank
Thông tin chủng Mã Độ tƣơng đồng (%)
S. prasinopilosusN2 KR703669 99 S. costaricanus WZ162 FJ812352 99 Streptomyces sp. MJM3787 FJ799173 99 Streptomyces sp. MJM3859 EU603347 99 Streptomyces sp. MJM3635 EU603346 99 Streptomyces sp. GS15 JX679244 99
Nhằm định tên chủng R12-4 đến loài, bên cạnh các kết quả về đặc điểm sinh hóa, cần kết hợp thêm trình tự gen 16S rRNA. So sánh trình tự gen 16S rRNA của xạ khuẩn nội sinh R12-4với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn nghiên cứucó độ tương đồng cao với các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Streptomyces sp như: S. prasinopilosus N2 (KR703669) 99%; S. costaricanus WZ162 (FJ812352) 99%. (Bảng 3.12.). Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, xạ khuẩn nội sinh R12-4 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với loài
Streptomyces prasinopilosusnên chủng xạ khuẩn này được đặt tên là Streptomyces prasinopilosusR12-4,và được đăng ký trên ngân hàng Genbank (Phụ lục 2).