Để có thể nghiên cứu và thu nhận được các chủng xạ khuẩn nội sinh có độ đa dạng cao và thu được các chủng xạ khuẩn quý, tiến hành thu thập các mẫu thực vật (rễ, cành) của cây cam trồng trên sườn núi và khoảng 7 năm tuổi tại Tuyên Quang. Trong đó, có 5 mẫu lấy tại thôn Đèo Ẳng, xã Bình Xa, huyện Hàm Yên và 5 mẫu lấy tại thôn Hốc Trai, Tp Tuyên Quang. Các vườn cam này ít được chăm bón và không sử dụng nhiều thuốc hóa học.
Trên cơ sở tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh chúng tôi lựa chọn một số môi trường nghiên cứu để phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên Tuyên Quang như sau:Môi trường có chứa axit humic, sodium propionate, protine, nước chiết lá cam Hàm Yên.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ cam Hàm Yên, Tuyên Quang trên một số môi trường khác nhau
STT Mẫu Môi trường phân lập
Số lượng xạ khuẩn (CFU/g sinh khối
thực vật)
Số loại khuẩn lạc xạ khuẩn và đặc điểm
1 R8 Humic acid 223 5 loại khuẩn lạc
- 19 khuẩn lạc trắng ngà - 12 khuẩn lạc xám - 7 khuẩn lạc xanh rêu - 4 khuẩn lạc da cam
- 8 khuẩn lạc xám có mũ trắng
Sodium propionate
285 4 loại khuẩn lạc
- 23 khuẩn lạc xám,vòng tan - 15 khuẩn lạc trắng nhỏ - 19 khuẩn lạc trắng ngà - 7 khuẩn lạc da cam, phấn
trắng
Protine 196 4 loại khuẩn lạc
- 12 khuẩn lạc trắng, phấn nâu - 15 khuẩn lạc nâu, có vòng tan - 8 khuẩn lạc trắng ngà - 9 khuẩn lạc trong Nước chiết lá 266 4 loại khuẩn lạc - 33 khuẩn lạc trắng nhỏ - 12 khuẩn lạc xanh rêu - 4 khuẩn lạc da cam - 11 khuẩn lạc xám nâu
2 R4 Humic acid 118 3 loại khuẩn lạc :
- 1 khuẩn lạc màu xám đen - 7 khuẩn lạc màu xám có
mũ trắng ở giữa - 19 khuẩn lạc trắng Sodium propionate 109 2 loại khuẩn lạc - 1 khuẩn lạc trắng xẻ thuỳ - 24 khuẩn lạc trắng
Protine 74 3 loại khuẩn lạc
- 1 khuẩn lạc màu xám có đốm đen ở giữa
- 1 khuẩn lạc màu da cam - 15 khuẩn lạc trắng Nước
chiết lá
78 2 loại khuẩn lạc
- 2 khuẩn lạc xám có đốm trắng
- 16 khuẩn lạc trắng
3 R10 Humic acid 169 4 loại khuẩn lạc
- 18 khuẩn lạc trắng - 17 khuẩn lạc nâu - 7 khuẩn lạc da cam - 5 khuẩn lạc đen
Sodium propionate 180 3 loại khuẩn lạc - 21 khuẩn lạc trắng - 19 khuẩn lạc nâu - 11 khuẩn lạc da cam
Protine 138 3 loại khuẩn lạc
- 14 khuẩn lạc trắng - 15 khuẩn lạc da cam - 10 khuẩn lạc nâu Nước chiết lá 159 4 loại khuẩn lạc - 23 khuẩn lạc trắng - 12 khuẩn lạc da cam - 6 khuẩn lạc nâu - 4 khuẩn lạc đen
Qua kết quả khảo sát trên các môi trường phân lập cho thấy môi trường có chứa axit humic cho số lượng chủng loại xạ khuẩn nhận được là đa dạng nhất. Vì vậy môi trường chúng tôi lựa chọn sử dụng cho phân lập là môi trường có chứa axit humic.
a b c d
Hình 3.1. Hình ảnh minh học kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên một số môi trường sau 6 tuần nuôi cấy, Môi trường humic acid (a), protine (b), sodium propionate
(c), nước chiết lá Cam Hàm Yên (d)
Từ 20 mẫu cành và rễ của cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang đã phân lập và thuần khiết được 40 chủng xạ khuẩn nội sinh. Kết quả phân lập cho thấy, tổng số loại khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được chia theo bộ phận thực vật và các nhóm màu thể hiện được sự đa dạng của các chủng xạ khuẩn.
Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây cam Hàm Yên Số lượng xạ khuẩn chúng tôi thu nhận được trên các mẫu rễ là đa dạng nhất. Số lượng xạ khuẩn thu được trên mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu cành (rễ 62,5%, cành 37,5%), đồng thời sự đa dạng về chủng loại trên mẫu rễ cũng cao hơn hẳn. Kết quả nghiên cứu này khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới. Nhóm nhiên cứu của Zhao và cộng sự (2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc. Tỷ lệ phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh cao nhất ở rễ (58,2 %), thân (27,8 %) và lá (14%) [59]. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết luận của Verma (2009) [55] phần lớn xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ nhiều hơn các cơ quan khác. Và các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quýt ở miền Bắc Thái Lan hầu hết đều thuộc chi Streptomyces (chiếm 85,3%) [45].
Bảng 3.2. Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu
Màu Trắng Xám Xanh rêu Da cam Nâu Đen Vàng
Tỷ lệ xạ khuẩn theo
nhóm màu (%) 81,44 2,59 0,65 11,91 1,57 0,46 1,39
Trên môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng với 7 màu tương ứng (Bảng 1). Xạ khuẩn màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất (81,44%), gấp 176 lần so với nhóm màu đen – là nhóm chiếm tỷ lệ thấp nhất (0,46%), và gấp 7 lần so với nhóm có tỷ lệ đứng thứ 2 màu cam (11,91%).