DNA tổng số của chủng C12 được tách chiết theo phương pháp của Sambrook & Russell (2001) [40].Gen mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492R (5'-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3') theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm SeqAssem version 01/2005 và Sequencher version 4.0.5. Mức độ tương đồng của gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA. Mức độ tương đồng di truyền của các chủng được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11.
2.2.5. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh
Tách chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. Hoạt chất kháng nấm do xạ khuẩn sinh tổng hợp có thể nằm trong sinh khối hay trong dịch nuôi cấy. Vì vậy để
tách chiết kháng sinh thì cầnlựa chọn dung môi thích hợp cho từng phương pháp tách chiết.
Tách chiết kháng sinh từ sinh khối
Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30o
C , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15 phút, loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối với nước cất đã khử trùng để loại bỏ các thành phần môi trường bám quanh sinh khối. Cân 3g sinh khối + 30ml dịch dung môi, lắc trên máy lắc 150 v/p. Sau 24 giờ ly tâm, thu dịch chiết. Thử hoạt tính kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.
Tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30o
C , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15 phút, loại sinh khối, thu dịch lọc.Chia dịch thành 4 phần. Chỉnh dịch về 3 pH: 3, 7 và 10 và đối chứng không chỉnh pH. Bổ sung dung môi vào dịch lọc theo tỷ lệ 1:1 lắc trên máy lắc 150 v/p ở 28oC. Sau 24 giờ để lắng, ly tâm thu lấy dịch chiết. Thử hoạt tính kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.
Tinh sạch kháng sinh
Dịch chiết kháng sinh từ sinh khối hay dịch nuôi cấy được cho bay hơi dung môi đến khi còn khoảng 1/5 so với lượng dịch ban đầu. Để dịch chiết sau bay hơi ở 4oC, 24 giờ xuất hiện kết tủa. Ly tâm lạnh ở 4oC, 12000 v/p trong 5 phút, tách riêng dịch và tủa. Làm khô tủa thu được kháng sinh thô dạng bột.
Quy trình tinh sạch kháng sinh thô
- Chuẩn bị cột tách: Cột có đường khính 2cm, chiều dài 30cm. Chất nhồi (pha tĩnh ) silicagel 0,04 ÷ 0,06 mm của Tay Ban Nha. Nhồi cột bằng kỹ thuật nhồi cột khô, cùng bơm nén và để một ngày cho ổn định cột.Chiều dài của pha tĩnh là khoảng 20cm.
- Chuẩn bị chất cần tách
Cân khoảng 0,5g hỗn hợp chất cần tách hoà tan trong 20ml methanol, cân 1g silicagel cho vào dung dịch, cô đuổi dung môi trên nồi cách thuỷ chân không đến khô thu được mẫu bột silicagel hấp phụ các chất cần tách.
- Chuẩn bị pha động để rửa giải
Pha động là hỗn hợp dung môi n-hexan – chloroform – methanol tỷ lệ tương ứng về thể tích 7:4:2, được trộn đều đồng nhất.
Đưa mẫu silicagel hấp phụ chất lên cột, dung pha động để rửa giải các chất, dung dịch ra khỏi cột được thu vào ống 10ml (gọi là 1 phân đoạn), thu lấy 44 phân đoạn như vậy, kiểm tra bằng bản mỏng xác định phân đoạn từ 28 đến 44 chỉ có một chấm tròn sắc nét có cùng hệ số Rf trên UV 366nm cũng như axit sunfuric đặc đun nóng, từ đó kết luận phân đoạn 28 ÷ 44 là một chất sạch, gộp các phân đoạn này với nhau và để bay hơi tự nhiên thu được tinh thể chất rắn. Chất rắn sạch này được đo phổ hấp thu phân tử UV – VIS, phổ hồng ngoại (Infrared (IR) spectroscopy).
2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn
* Xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh
Xử lý dịch kháng sinh thô ở các pHkhác nhau: pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 và 9 bằng NaOH 0,5M và CH3COOH 0,4M và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau đó chỉnh các mức pH trên về pH 7 rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch. * Xác định khả năng bền với nhiệt độ của chất kháng sinh
Xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau 40o
C, 70oC, 80oC và100oC kéo dài 30, 60, 90 và 120 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN