Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Nghiên cứu đặc điểm sinh họctheo phương pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS), sắc tố melanin và sắc tố tan tiết ra môi trường được đánh giá theo Shirling và Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner và Backus. Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh... [44,54].

Hình dạng cuống sinh bào tử và cấu trúc bề mặt bào tử của xạ khuẩn nghiên cứu được quan sát dưới kính hiển kính hiển vi điện tử quét JSM-5000 tại Viện Vật liệu, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales). Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy) [36].

Sự hình thành sắc tố melanin: Sắc tố melanin được kiểm tra trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 sau 7 ÷ 14 và 21 ngày nuôi cấy. Nếu sinh melanin, màu sắc tố xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường nuôi sẽ chuyển từ màu vàng nâu sang màu đỏ đậm cho đến màu đen [36].

Khả năng sử dụng các nguồn cacbon: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung thêm 1% các nguồn đường tương ứng: Glucose, Arabinose, Sucrose, Manitol, Xylose, Fructose, Cellulose, Rafinose, Rhamnose. Kiểm tra sinh trưởng sau 7 ÷ 14 ngày ở

nhiệt độ 28 ÷ 30oC. Môi trường có glucosa được coi là đối chứng dương, môi trường không đường được coi là đối chứng âm [36].

Xác định nhiệt độ tối ưu: Chủng được nuôi trên môi trường thạch Bennet ở nhiệt độ 10; 15; 22; 28; 30; 35; 37; 40; 45; 50; 55 và 60oC. Sau 7 ÷ 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng.

Xác định pH tối ưu: Xạ khuẩn nuôi cấy trên môi trường dịch thể Bennet đã chỉnh pH từ 2 ÷ 12. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 5 ÷ 7 ngày thu dịch và tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối để từ đó xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng chịu NaCl: Môi trường ISP 2 dịch thể có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 và 7,0 (%). Nuôi lắc xạ khuẩn 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 7 ngày thu dịch và tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối và xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa ISP 2. Sau khi phát triển tốt, dùng que cấy vô trùng cấy chấm điểm lên các đĩa Petri chứa môi trường Gauze 1 có bổ sung các cơ chất đặc hiệu: tinh bột để xác định hoạt tính amylase, casein để xác định hoạt tính protease, chitin để xác định hoạt tính chitinase, CMC (Cacboxyl Methyl Cellulose) để xác định hoạt tính xenlulase. Sau 5 ngày nuôi ở 28ºC, xác định khả năng sinh tổng hợp các amylase bằng thuốc thử Lugol, protease bằng thuốc thử tricloacetic, chitinase bằng congo đỏ 0,5%. Khả năng sinh enzym được xác định bằng giá trị D-d (mm), trong đó D là đường kính vòng thủy phân cơ chất, d là đường kính khuẩn lạc.