Các mẫu thực vật từ cây cam được lấy và lưu giữ trong túi nilon riêng rẽ. Mỗi mẫu cây được chia thành 3 phần riêng: Rễ, cành, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 7 ngày.
Phương pháp tiến hành: Mẫu rễ, cành hoặc lá được rửa sạch bề mặt. Sau đó, mẫu lá được cắt thành các mẩu nhỏ (kích thước 1 x 1 cm), mẫu cành hoặc rễ được cắt thành các đoạn dài 1 cm. Các mẫu đã cắt được ngâm ngập trong dung dịch 5 % sodium hypochlorite (NaOCl) trong 1 phút, tiếp đó được xử lý với cồn 70 % trong 5 phút rồi được rửa bằng nước cất khử trùng 5 lần. Các mẫu thực vật sạch này được giã nhỏ và bổ sung vào đĩa môi trường khoáng humic, có chứa chất kháng nấm (nystatin 100 mg/lít) và chất kháng khuẩn nalidixic acid (10 mg/lít). Các đĩa thạch được nuôi ở 30oC và phân lập các chủng xạ khuẩn xuất hiện trên môi trường sau 15 ÷ 60 ngày. Các mẫu xạ khuẩn này được thuần khiết và giữ trên môi trường ISP2 và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn
Khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên khả năng đối kháng của các chủng này với một số chủng nấm bệnh trên cây có múi (Colletotrichum truncatum VSVD 14,Geotrichum candidum VSVĐ 5, Fusarium oxysporum FO5 và Fusarium udum VSVĐ 2) và một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) kiểm định bằng phương pháp cục thạch và phương pháp khuếch tán trên thạch.
Kiểm tra khả năng đối kháng do cạnh tranh nguồn dinh dưỡng
Thí nghiệm được tiến hành song song bằng cách chuyển nấm bệnh được nuôi trên môi trường PDA từ đĩa giống sang 1 đĩa môi trường PDA mới, nấm được đặt cách vị trí xạ
khuẩn là 3cm ; mẫu thí nghiệm đối chứng được nuôi ủ và theo dõi. Khả năng ức chế nấm được tính toán theo công thức: AB = B – A. Trong đó AB là hoạt động ức chế sự phát triển của nấm, A = khoảng cách của nấm tới khuẩn lạc của xạ khuẩn. B = đường kính phát triển của nấm trên môi trường đối chứng. Tỷ lệ AB sẽ được đánh giá như sau: < 1mm: không có ức chế; 1 ÷ 9mm (+); 10 ÷ 19mm (++); >20mm (+++) [32].
Sản xuất các chất kháng khuẩn và kháng nấm: Xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường kiểm tra lỏng ở 30°C, 150 vòng/phút trong 4 ngày. Ly tâm thu 5ml dịch, bổ sung 5ml ethylacetate. Hỗn dịch được huyền phù hóa trong 45 phút, sau đó ly tâm thu dịch trong ở 12000 vòng/phút, 10 phút. Dịch sau ly tâm cho bay hơi trong một giờ và thu phần dịch còn lại. Phần dịch (5ml) bổ sung 5ml ethyl acetat và cho bay hơi trong 30 phút. Đối chứng âm dịch sau lên men được thay bằng nước cất [28]. Hoạt tính kháng nấm được thử bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.