Tách chiếtchất kháng nấm

Khả năng hoà tan của chất kháng nấm trong các dung môi khác nhau là một yếu tố cần được chú ý để thu nhận chất kháng nấm . Tuy nhiên, độ hoà tan của chất kháng sinh rất khác nhau trong các loại dung môi . Để xác đi ̣nh được dung môi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh của xa ̣ khuẩn , xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường lên men AH 4

ở nhiệt độ 30oC và pH 7,0. Dịch kháng nấm thô được chiết bằng 7 loại dung môi khác nhau (Bảng 3.16). Dịch kháng nấm sau khi chiết rút được tẩm vào khoanh giấy lọc , cho bay hơivà xác đi ̣nh hoạt tính kháng nấm (VSV kiểm định là F. oxysporum FO5). Kết quả được thể hiện trên bảng 3.16.

Bảng 3.16. Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh khối STT Dung môi hữu cơ Hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4 ( D-d,mm)

Sinh khối Dịch ngoại bào

1 Etyl axetate 6 13 2 n-butanol 10 8 3 Methanol 16,5 7 4 Iso propanol 11,5 10 5 Ethanol 10 8 6 Aceton 12,5 11

7 Iso amyl alcohol 5,5 7

Kết quả cho thấy, chất kháng nấm của chủngR 12-4 nằm trong cả sinh khối và di ̣ch ngoại bào . Cả bảy loại dung mô i trên đều có thể sử du ̣ng để tách chiết chất kháng nấm . Trong bảy loa ̣i dung môi sử du ̣ng , để chiếtchất kháng nấm từ sinh khối , methanol là dung môi cho hiệu quả cao nhất , dịch chiết bằng dung môi này có vòng kháng là 16,5 mm. Để tách kháng sinh từ di ̣ch ngoa ̣i bào thì etyl acetate la ̣i cho hiệu quả cao hơn . Theo kết quả của nhiều nghiên trước đã công bố , có nhiều loại dung môi được sử dụng để tách chiết CKS từ xa ̣ khuẩn. Tuy nhiên, việc sử du ̣ng loa ̣i dung môi nào là thích hợp la ̣i tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của từng loại CKS [1, 12].

Khả năng hoà tan của chất kháng nấm trong dung môi còn phụ thuộc vào pH . Để xác đi ̣nh pH cho hiệu quả tách chiết chất kháng nấm cao nhất , chúng tôi tiến hành tách chiết CKS từ di ̣ch ngoa ̣i bào trong 7 loại dung môi trên ở các pH 3, pH 7 vàpH10. Kết quả thể hiện trên bảng sau:

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm

STT Dung môi Hoạt tính kháng nấm ( D-d, mm)

pH 3 pH 7 pH 10 K.chỉnh pH ĐC (-) ĐC (+) 1 Etyl Acetate 10 13 11 13 0 16,5 2 n-butanol 6 8 6 8 0 3 Methanol 11,5 7 5 7 0 4 Iso propanol 9 10 6 10 0 5 Ethanol 10 7 4 8 0 6 Aceton 12 8 5 11 0

Kết quả thể hiện trên bảng 3.17.cho thấy, chủng R12-4 ở pH 7, hầu hết di ̣ch chiết đều có hoạt lực cao hơn so với dịch chiết trong các dung môi có pH 3 và pH 10. Điều này đã chứng tỏ khả năng hoà tan trong dung môi của các chất kháng nấm tốt nhất trong môi trường có pH trung tính (pH 7).

Với dịch lọc pH3, aceton có hiệu quả tách chiết kháng sinh cao nhất.Ethyl acetate là dung môi tốt nhất khi chiết kháng sinh từ dịch lọc pH7 và pH 10. Khi đưa về 4°C, dịch chiết với methanol và ethyl acetate có thể tạo kết tủa (kháng sinh thô) trong khi dịch chiết aceton thì không. Do đó lựa chọn methanol làm dung môi để chiết kháng sinh từ sinh khối và ethyl acetate làm dung môi chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh R12-4.

Một điểm cần lưu ý là pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến việc chiết kháng sinh đi ra ngoài môi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều [4].Vì vậy, để tách chiết chất kháng nấm từ chủng R 12-4 có hiệu quả, nên tách chiết ở trong môi trường trung tính . Kiểm tra hoạt tính kháng nấm của phần dịch chiết với dung môi trước và sau khi cho bay hơi, phần kháng sinh thô thu được và dịch dung môi sau khi tách kháng sinh thô ra. Khi tách chiết từ sinh khối bằng dung môi methanol và tách chiết từ dịch lọc bằng dung môi ethyl acetate, hoạt tính kháng nấm sau bay hơi (trước khi tạo kết tủa) đều cao hơn so với trước khi bay hơi dung môi. Đưa các mẫu sau bay hơi dung môi về 4°C để tạo tủa (kháng sinh thô).Ly tâm lạnh tách kháng sinh thô và phần dung môi sau ly tâm. Dung môi sau ly tâm hầu như không còn hoạt tính kháng nấm, chứng tỏ hoạt chất kháng nấm đã kết tinh hoàn toàn.

3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm

Để xác đi ̣nh khả năng bền nhiệt của chất khá ng nấm, tiến hành nuôi xa ̣ khuẩn trên môi trường lên men thích hợp .Thu dịch kháng sinh thô để xử lý với nhiệt độ 40, 70, 80 và 100°Ctrong các khoảng thời gian 30, 60, 90 và 120 phút.Xác định hoạt tính của dịch kháng nấm bằng phương pháp đục lỗ.Kết quả thể hiện trên bảng 3.18.

Chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 là tương đối bền với nhiệt. Hoạt chất kháng nấm hầu như không thay đổi theo thời gian xử lý. Khi tăng nhiệt độ xử lý từ 80 ÷ 100 °C, hoạt tính có giảm dần nhưng mức độ giảm không nhiều.Đặc biệt ở 100 °C với thời gian xử lý 120 phút, hoạt chất kháng sinh của dịch chiết vẫn còn khoảng 70 % so với ban đầu.

Bảng 3.18. Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4 Thời gian (phút) Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) ở các nhiệt độ ( °C )

28 40 70 80 100 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 30 22 21 21 20 21 20 21 19 20 19 60 23 20 20 20 20 19 20 19 18 17 90 21 20 19 19 20 21 17 16 16 16 120 22 21 20 20 21 20 16 15 14 13

a b

c d

Hình 3.13. Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt (a) 30 phút, (b) 60 phút, (c) 90 phút và (d) 120 phút

Theo kết quả công bố của một số nghiên cứu trước về khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh thu nhận từ xạ khuẩn, có nhiều chất kháng sinh có khả năng bền với nhiệt độ, ở 70°C trong thời gian 60 phút, hoạt chất kháng sinh vẫn hầu như không thay đổi, thậm chí, ở 100°C và kéo dài đến 60 phút, hoạt chất kháng sinh vẫn còn khoảng 50% hoặc chỉ giảm đi đôi chút[1, 3]. Tuy nhiên bên cạnh đó, một số chất kháng sinh không bền nhiệt, hoạt tính kháng sinh bị giảm hoặc mất hoàn toàn ở 50°C[12].Như vậy so sánh với các kết quả nghiên cứu trước, chất kháng sinh chủng R12-4 thuộc loại bền nhiệt.Đây là một tính chất rất thuận lợi cho việc tách chiết, tinh chế và bảo quản chất kháng nấm.

3.4.3. Khảnăng bền với pH của chất kháng nấm

Khả năng bền vững của chất kháng nấm với pH là một đặc điểm đáng chú ý vì điều này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ tách chiết mà còn có ý nghĩa t rong ứng du ̣ng . Để xác đi ̣nh khả năng bền với pH của chất kháng nấm , dịch kháng nấm thô được điều chỉnh về các pH 3 ÷ 9 và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7. Hoạt chất kháng nấm của di ̣ch chiết được x ác định bằng phương pháp đục lỗ .Kết quả được thể hiện trên hình 3.14 và hình 3.15.

Hình 3.15. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm

Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c,d) G. Candidum

Kết quả trên Hình 3.14 và hình 3.15 cho thấy, dịch kháng nấm của chủng R 12-4 vẫn giữ được hoa ̣t tính ở trong dải pH 3 ÷ 9 trong thời gian 60 phút đã chứng tỏ : các chất kháng nấm này đều có khả năng bền với pH . Dịch chiết kháng nấm có hoa ̣t lực ma ̣nh nhất ở pH7, hơi giảm dần trong các môi trường axit và kiềm .Tuy nhiên , mức độ giảm không nhiều.Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chất kháng nấm từ chủng R12-4 thuộc loại bền với pH. Đây là một đặc điểm rất lợi thế trong công nghiệp thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng thời mở rộng khả năng ứng dụng của chất kháng sinh này

3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng nấm 0 5 10 15 20 25 Hoạt tính kháng nấm (D, mm) 3 4 5 6 7 8 9 7,3 (ĐC) pH thử nghiệm F. oxysporm Geotrichum candidum

Hình 3.14. Độ bền của chất kháng nấm với

pH

a

b

Chất kháng nấm thô được tách chiết từ sinh khối hoặc dịch nuôi cấy được tiến hành tinh sạch theo quy trình mục 2.2.5, phần vật liệu và phương pháp, thu được kháng nấm tinh sạch. Kiểm tra hoạt tính kháng nấm của kháng sinh tinh sạch thu được cho thấy kháng sinh vẫn giữ nguyên được khả năng kháng vi sinh vật kiểm định ban đầu.

a b c

Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c) G. candidum

Hình 3. 16. Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch

Hình 3. 17. Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch Trên phổ UV đo trong dung môi methanol xuất hiện 3 đỉnh cực đại hấp thụ ở bước sóng 322; 338 và 357nm, phổ khá gọn và sắc nét chứng tỏ mẫu kháng sinh đem phân tích là tinh sạch.

Hình 3.18. Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch Trên phổ IR xuất hiện các dao động đặc trưng của các liên kết (cm-1

): Trên Phổ IR xuất hiện dao động dặc trưng của các liên kết (cm-1

): 3313(-OH); 2943; 2831(CH bão hòa); 1448; 1413 (biến dạng CH); 1020(C-O). Qua phổ IR dự đoán chất kháng nấm củ chúng tôi có chứa nhiều nhóm OH liên kết với C.

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

1. Từ 20 mẫu rễ, cành cây cam thu thập ở Hàm Yên – Tuyên Quang, đã phân lập được 40 chủng xạ khuẩn. Số lượng xạ khuẩn thu được trên mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu cành (rễ 62,5%, cành 37,5%). Trên môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng với 7 màu tương ứng trong đó, nhóm trắng chiếm tỷ lệ cao nhất (81,44%), nhóm vàng cam chiếm 11,91%, nhóm xám 2,59% nhóm xanh rêu 0,65 và nhóm nâu 1,57, vàng 1,39 và đen 0,46%.

2. Trong số 40 chủng phân lập được có: 30% xạ khuẩn kháng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, 12,5% kháng P.aeruginosa, 2,5% kháng B.subtilis. Đối với các chủng nấm kiểm định, có 30% xạ khuẩn nội sinh phân lập được đối kháng với

G.candidumvà Colletotrichum,12,5% kháng F. udum, F. oxysporum

3. Đã lựa chọn được 2 chủng R12-4 và C12 có hoạt tính kháng nấm cao để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại cho kết quả 2 chủng đều thuộc chi

Streptomyces. Dựa trên phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rRNA chủng C12thuộc loàiS. angustmyceticus, được định danh làS. angustmyceticus C12 và chủng R12-4 thuộc loàiStreptomycesprasinopilosus, được định danh làS. prasinopilosus R12-4

4. Đã nghiên cứu được môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ khuẩn nội sinh R12-4 và C12: hoạt chất kháng nấm được sinh tổng hợp tốt nhất trên môi trường AH4, 28 ÷ 30°C, pH 7,0.

5. Đã nghiên cứu tách chiết sơ bộ hoạt chất kháng nấm từ chủng R12-4: chiết chất kháng nấm từ sinh khối của chủng R12-4 bằng dung môi methanol ở pH 7,0. Tách chiết từ dịch lên men bằng dung môi ethyl acetate ở pH 7,0.

6. Đã kiểm tra được tính chất hóa lý của chất kháng nấm từ chủng R12-4: chất kháng nấm bền ở nhiệt độ dưới 80°C và trong khoảng pH 5 ÷ 9.

7. Đã thu được sản phẩm có hoạt tính kháng nấm tinh sạch. Chất kháng nấm được phân tích bằng phổ UV VIS và phổ hồng ngoại.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc hoá học của chất kháng nấm thu nhận từ chủng xạ khuẩn S. angustmyceticus C12và S. prasinopilosus R12-4.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh ho ̣c , 2006,

2. Cao Ngọc Điệp, Phan Thị Nhã (2011), Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây Khóm (Ananas comosus [L.]) trồng trên đất phèn thị xã vị thanh, tỉnh Hậu Giang, Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(2): 243-250. 3. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội.

4. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Việt Nam.

5. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai Ngọc Toàn (2005), Chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm

Aspergillus awamori Nakazawa kí sinh trên cây sảng Sterculia lanceolata

Car họ Sterculiaceae, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 43 (6A): 132-136 6. Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997), Phân lập nghiên cứu các chất chiết từ

nấm nội kí sinh trong cây Taxus chinensis, Kỷ yếu-Annual report, Viện Hóa Học.

7. Lương Thị Hồng Hiệp, Cao Ngọc Điệp (2011), Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyên chi (Twedelia trilobata (L.) hitche.) bằng kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học, 18a: 168-176

8. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr. 53 – 71.

9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (2007) vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.

10.Nguyễn Sỹ Giao (1971), Nghiên cứu định hướng ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong môi trường cây non phục vụ nghề trồng rừng, Tập san lâm nghiệp (4): 23-28

11.Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học sư Phạm Hà Nội.

12.Nguyễn Thi ̣ Thu Thuỷ , Hoàng Thị Kim Hồng (2009): Nghiên c ứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa màu ở Thừa Thiên Huế. Hội nghị CNSH toàn quốc 2009.

13.Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội.

14.Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây cao su có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola, Tạp chí Sinh học, 36(1se): 173-179.

Tiếng Anh

15.Alipour H., Hosein B. A., Jahed M., Rahnama H., Sharifnia M., (2013). A Review on Citrus Production and Export Marketing Strategies in Mazandaran Province Iran, Middle-East Journal of Scientific Research, 14 (10): 1375-1380

16.Bacon C.W. and White J.F., 2000. Microbial Endophytes. Marcel Dekker, New York, pp: 341-388

17.Cao L.X., Qiu Z.Q., You J.L., Tan H.M., Zhou S. (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium with phathogen from surface-sterilized banana roots. FEMS Microbiol Lett 247: 147-152 18.Conn V.M. and Franco C.M.M. (2004). Analysis of the endophytic actinobacterial population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones. Appl Environ Microbiol, 70: 1787-1794.

19.Conn V.M., Walker A. R., Franco C.M.M (2008), Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Microbe Interact, 21 (2): 208-218.

20.Coombs J.T. and Franco C.M.M. (2003). Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat root. Appl Environ Microbiol, 69:5603-5608.

21.De Aráujo J M , da Silva A C and Azevedo J L (2000) Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of maize (Zea mays L.). Brazilian Archvies of Biology and Technology 43: 447-451 .

22.El-Tarabily, K. A. & Sivasithamparam, K. Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Soil Biol. Biochem. 38, 15.

23.Gangwar M, S. Dogra, N Sharma (2011), Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plans, J Advanced Lab Research in Biology 2(4): 154-157.

24.Gangwar M., Dogra S., Gupta U. P., Kharwar R. N. (2014). Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, African Journal of Microbiology Research, 8(2): 184-191.

25.Hong Y.Z., Quan H.X., Ming T., Guang H.S. (2013), Effect of actinomycetes on ginseng growth and production of ginsenosides, J Food Agr Environ 11(1): 557- 559.

26.Igarashi Y. (2004).Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes. Actinomycetologica 18:63–66

27.Inderiati S. and Muliani S. (2008). Isolation and characterization of endophytic actinomycetes of tobacco plants. Journal of Agrisistem 4: 82-100.

28.Intra B., Mungsuntisuk I., Nihira T., Igarashi Y., Panbangred W. (2011). Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease. BMC Research Notes, 4:98.

29.Kandpal K. C., Jain D. A., Kumar U., Tripathi R., Kumar T. S. (2012). Isolation