2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA
Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập cơ sở dữ liệu của các trình tự gen 47-kDa
của các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á từ ngân hàng gen NCBI, kết quả có tất cả 37 trình tự đã được tìm thấy (trong đó có 17 trình tự của các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam (số truy cập: LC431268.1, LC431269.1, LC431270.1, LC431271.1, LC431272.1, LC431273.1, LC431274.1, LC431275.1, LC431276.1, LC431277.1, LC431278.1, LC431279.1, LC431280.1, LC431281.1, LC431282.1, LC431283.1, LC431284.1), 18 trình tự của Thái Lan (số truy cập: HM595489.1, HM595490.1, HM156064.1, HM156058.1, HM156057.1, HM156053.1, HM156048.1, HM156047.1, HM156059.1, HM156056.1, HM156055.1, HM156052.1, HM156051.1, HM156050.1, HM156049.1, HM156054.1, HM156060.1, HM156061.1) và 2 trình tự của Lào (số truy cập: NZ_LYMB01000234.1 và NZ_LYMT01000188.1)).
Các trình tự này sau đó được đánh giá tính đa hình bằng phần mềm ClusterW nhằm chọn ra vùng gen có tính đa hình thấp và độ tương đồng cao giữa các chủng trong nước và khu vực Đông Nam Á.
Mồi ngược được nhóm nghiên cứu tham khảo theo thiết kế trước đó bởi Chao et al., 2015 [42]; mồi xuôi và probe được thiết kế lại đảm bảo đặc hiệu 100% với các chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á Các trình mồi và probe được tổng hợp bởi IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.).
2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo
Chứng dương nhân tạo chứa trình tự gen đích 47-kDa của O. tsustugamushi
được tổng hợp bởi IDT (Coralville, IA). Đoạn trình tự có kích thước khoảng 500bp 47-kDa gene được tổng hợp tương đồng hoàn toàn với hầu hết các trình tự của các chủng O. tsustugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dữ liệu thu thập từ Genbank. Sau khi nhận về, lyophilized plasmid DNA được xử lý theo đề xuất của nhà sản xuất và được pha với TE để tạo ra dải các nồng độ DNA O. tsutsugamushi khác nhau.
Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo
2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm nghiên cứu thiết kế nghiên cứu thiết kế
Nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra hiệu suất khuếch đại của các trình tự mồi/ probe do nhóm nghiên cứu thiết kế bằng phản ứng real-time RPA theo đề xuất của nhà sản xuất (TwistAmp exo). Nồng độ và thành phần phản ứng chi tiết được trình bày ở Bảng 2.1
Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA STT Thành phần C_f Đơn vị Thể tích 1 Reaction Buffer 1 x 10 2 dNTPs 1,8 mM 1,44 3 H2O 0,24 4 Probe E-mix 1 x 2 5 Mồi xuôi 0,42 µM 0,48 6 Mồi ngược 0,42 µM 0,48 7 Probe 0,12 µM 0,24
8 Core Reaction Mix 1 x 1
9 Exo 1 x 0,4
10 Template 2
11 MgOAc 14 mM 1
Phản ứng được thực hiện ở 37℃ trong 30 phút trên thiết bị máy Genie®II (Hình 2.3 ). Thiết bị Genie® II được thiết kế nhỏ gọn, nhẹ và dễ dàng mang đi, phù hợp để thực hiện bất kỳ phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt nào phát hiện sản phẩm khuếch đại qua thu nhận tín hiệu huỳnh quang. Thiết bị này yêu cầu năng lượng thấp và sử dụng pin Lithium-polymer có thể sạc lại và giữ cho máy hoạt động cả ngày nên có thể dễ dàng mang đi, phù hợp với các khu vực thường xuyên xảy ra bệnh sốt mò như vùng trung du, núi đá vôi không gần với các trung tâm y tế lớn.
Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu 2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập
2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng
Phản ứng RPA có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 22 đến 45°C và không giới hạn về kiểm soát nhiệt độ [83], tuy nhiên, hầu hết các bài báo được công bố về tối ưu hóa cho nhiệt độ phản ứng RPA là từ 37 đến 41°C. Để kiểm soát nhiệt độ phản ứng, các thiết bị khác nhau có thể được sử dụng, bao gồm máy ủ, lò sưởi, lò sưởi hóa học [96] và nhiệt độ cơ thể [48], và cũng có các ví dụ về RPA hoạt động ở nhiệt độ môi trường xung quanh ở những vùng ấm (trên 30°C) [96].
Bộ kit TwistAmpTM chuẩn được thiết lập để hoạt động tối ưu ở dải nhiệt độ từ 37°C đến 41°C. Ở nhiệt độ cao hơn, hệ thống sẽ bị tổn hại khi các enzyme dần dần mất hoạt động. Ở nhiệt độ dưới mức tối ưu, Recombinase Polymerase Amplification (RPA) vẫn có thể hoạt động tốt tuy nhiên tốc độ phản ứng giảm.
- Nguyên lý: Để tối ưu nhiệt độ phản ứng, chúng tôi tiến hành đồng thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về các thành phần tham gia (như Bảng 2.1) chỉ khác nhau nhiệt độ phản ứng. Sau khi thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân
tích để tìm nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất với thời gian phát hiện sớm nhất và tín hiệu huỳnh quang thu được là tốt nhất.
- Dải gradient nhiệt độ sử dụng tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: Chúng tôi sử dụng dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C theo đề xuất của nhà sản xuất TwistAmpTM và một vài nhiệt độ nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất (45℃ và 50℃) nhằm khảo sát hiệu suất của phản ứng RPA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau và chọn ra nhiệt độ phản ứng tối ưu.
2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng
Các điều kiện phản ứng tiêu chuẩn được cung cấp bởi nhà sản xuất TwistAmpTM tạo ra một môi trường phản ứng ‘thỏa hiệp’ khá tốt để khuếch đại nhanh và nhạy DNA. Tuy nhiên, tối ưu hóa các thành phần phản ứng sẽ giúp cải thiện hiệu suất khuếch đại đáng kể. Các thông số có thể dễ dàng được thay đổi trong quá trình nghiên cứu là nồng độ mồi/probe, nồng độ Magnesium-Acetate (MgOAc).
Tối ưu nồng độ mồi:
- Nguyên lý: Để tối ưu nồng độ các mồi,chúng tôi tiến hành đồng thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã tối ưu và các thành phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ mồi. Sau khi thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát hiện và cường độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ mồi cho kết quả tốt nhất - Dải nồng độ: Chúng tôi sử dụng dải nồng độ mồi đề xuất từ nhà sản xuất
để tiến hành chọn lọc nồng độ mồi tối ưu nhất cho phản ứng. Dải nồng độ được sử dụng là 0,24; 0,36; 0,42; 0,54 µM.
Tối ưu nồng độ probe:
- Nguyên lý: Giữ nguyên nồng độ mồi đã tối ưu, chúng tôi tiến hành đồng thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã tối ưu và các thành phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ probe. Sau khi thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát hiện và cường
độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ probe cho kết quả tốt nhất
- Dải nồng độ: Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ probe gồm 0,06; 0,08; 0,1; 0,12 và 0,15 µM.
Tối ưu nồng độ MgOAc
- Nguyên lý: Giữ nguyên nồng độ mồi và probe đã tối ưu, chúng tôi tiến hành đồng thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã tối ưu và các thành phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ MgOAc. Sau khi thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát hiện và cường độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ probe cho kết quả tốt nhất
- Dải nồng độ: Chúng tôi sử dụng dải nồng độ MgOAc lần lượt là 12 mM; 14 mM; 16mM; 18mM và 20mM.
2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại)
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit Orientia tsutsugamushi
Membrane Protease (htrA) gene (Primerdesign) được thiết kế có khả năng định lượng in vitro bộ gen O. tsutsugamushi. Bộ kit Primerdesign có thể phát hiện rộng rãi và đặc hiệu với hầu hết hệ gen của các loài O. tsutsugamushi. Mồi và probe trong bộ kit này có độ tương đồng 100% với một loạt các trình tự gen O. tsutsugamushi. Trong điều kiện PCR tối ưu, bộ kit Primerdesign phát hiện O. tsutsugamushi có hiệu suất bắt cặp rất cao > 95% và có thể phát hiện được ở mức ít hơn 100 bản sao gen đích/phản ứng
Nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện các phản ứng realtime PCR trên thiết bị máy Roto-GeneQ. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR được trình bày ở các bảng sau:
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR STT Thành phần V/mẫu Ghi chú
2 Hỗn hợp mồi và probe 0,5 µl Cung cấp bởi bộ kit 3 Nước khử RNase/
DNase 2,5µl
4 Khuôn 2 DNA/ Nước khử nuclease
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt
Các bước T° T.gian đ.vị Hoạt hóa enzyme 95 2 phút
Khuếch đại Biến tính 95 10 giây chu kỳ: 50 Thu nhận tín hiệu 60 60 giây
Lưu mẫu trên máy 25 ∞
2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện
Ngưỡng phát hiện của quy trình đẳng nhiệt RPA phát hiện O. tsutsugamushi
được đánh giá trên panel dải nồng độ plasmid tổng hợp nhân tạo 102 – 104 copy/p.ư, mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường - Orientia tsutsugamushi Membrane Protease (htrA).
Sử dụng quy trình RPA đã tối ưu thực hiện một loạt phản ứng RPA trên các mẫu chứa nồng độ DNA đã chuẩn bị. Ở mỗi nồng độ qua 6 lần lặp lại phải đảm bảo 6/6 lần mẫu phải cho đường tín hiệu khuếch đại tách biệt với tín hiệu nền trong thời gian thực hiện các phản ứng đánh giá ngưỡng phát hiện. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA là nồng độ thấp nhất mà quy trình RPA có thể phát hiện được ở tất cả các lần lặp lại.
2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường thị trường
2.7.1. Đánh giá độ nhạy
Chuẩn bị các mẫu dương tính giả định
Các mẫu bệnh phẩm dương tính giả định được chuẩn bị bằng cách bổ sung 100µl DNA O. tsutsugamushi tổng hợp nhân tạo với các nồng độ khác nhau (8 x 108, 5 x 108, 5 x 107, 8 x 105, 5 x 105, 8 x 104, 5 x 104, 5 x 103, 8 x 102, 5 x 102 copy/p.ư) vào 1ml máu của người khỏe mạnh. DNA sau đó được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) (ký hiệu mẫu tp1-tp10)
Phương pháp đánh giá
Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính trong tổng số các trường hợp có bệnh. Độ nhạy được xác định bằng công thức sau:
Độ nhạy = số ca dương tính thật
số ca dương tính thật + số ca âm tính giả
2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật khác
Các mẫu âm tính với O. tsutsugamushi (10 mẫu) là DNA tách từ máu toàn phần của người khỏe mạnh sử dụng bộ kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN). Các mẫu âm tính được thu thập tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y.
Các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò, gồm 10 chủng: Leptospira biflexa serovar Patoc, Leptospira interrogan serovar Pomona, Leptospira interrogan serovar Australis doViện Y học dự phòng Quân đội cung cấp,
Dengue virrus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabiles, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli do khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân Y cung cấp.
Phương pháp đánh giá
Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong tổng số các trường hợp không bị bệnh. Độ đặc hiệu được xác định bằng công thức sau:
Độ đặc hiệu = số ca âm tính thật
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Trình tự mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa của hầu hết các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á do nhóm nghiên cứu thiết kế:
Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi
Mồi/ probe Trình tự (5’-3’)
Mồi xuôi TAAAGTTGCATGATGGTTCAGAACTGATAGCA
Mồi ngược TATTGCAATAACCTGATCTCCTACTCTAGA
Probe 5’dATTAAAAATTAATTCTTCAGCAGCATTATCTTA-(FAM- dT)-GC-(THF)-AC-(BHQ1-dT)-TTTGGCGATTCA-3’ blocker
Kết quả đánh giá và so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen đích 47- kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á với trình tự mồi và probe trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs cho thấy các trình tự mồi xuôi và probe do nhóm nghiên cứu thiết kế là tương đồng 100% với các trình tự gen đích 47-kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á
Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của
O. tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao
và cs [38]
3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình tự mồi/ probe do nhóm nghiên cứu chế tạo được trình bày trên Hình 3.2. Kết quả cho thấy các trình tự oligos hoạt động tốt với đối chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm (khoảng 11 phút), đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ phản ứng là đặc hiệu, không có hiện tương mồi bắt cặp hay nhiễm chéo diễn ra trong quá trình phản ứng.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu
Đối chứng dươngO. tsutsugamushi: (+) (màu cam) và đối chứng âm: NTC (màu xanh)
3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA
Tối ưu điều kiện phản ứng
Dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C được khảo sát để chọn ra nhiệt độ phản ứng RPA tối ưu. Kết quả chỉ ra trong Hình 3.3 cho thấy nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37°C với thời gian thu nhận tín hiệu sớm nhất.
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)
38+ Nhiệt độ phản ứng 38℃ 11 39+ Nhiệt độ phản ứng 39℃ 11 40+ Nhiệt độ phản ứng 40℃ 12 41+ Nhiệt độ phản ứng 41℃ 12 45+ Nhiệt độ phản ứng 45℃ 12 50+ Nhiệt độ phản ứng 50℃ NA 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 45-, 50-
Đối chứng âm ở nhiệt độ phản ứng 37-41℃, 45℃ và 50℃
NA
Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Các phản ứng chứng dương cùng lượng khuôn DNA; phản ứng chứng âm không có khuôn DNA với nồng độ mồi là 0,42 µM, nồng độ probe là 0.1 µM.
Nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất của nhà sản xuất, các nhiệt độ 45 và 50℃ cũng được nhóm nghiên cứu thử nghiệm và đánh giá. Ở nhiệt độ 45℃, hoạt tính của enzyme không bị ảnh hưởng đáng kể, đối chứng dương vẫn cho tín hiệu khá sớm, tương đương với các nhiệt độ khác trong dải nhiệt độ tối ưu. Hoạt tính của các enzyme bị mất hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 50℃, đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại chứng dương giờ chỉ là tín hiệu nhiễu, không quá khác biệt so với tín hiệu chứng âm được thu nhận bởi thiết bị GenieII.
Kết quả thử nghiệm ở các nhiệt độ khác nhau với cùng một nồng độ mẫu chứng dương cho thấy, thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sớm nhất ở nhiệt độ 37°C (khoảng 10 phút). Do hạn chế về thời gian, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết bị GenieII, nhóm nghiên cứu chưa tiến hành các thử nghiệm trên các thiết bị giữ nhiệt hoặc ủ ấm thông thường. Nhưng với các kết quả nghiên cứu trên cũng cho thấy, kỹ thuật RPA hoàn toàn có thể được ứng dụng trên các thiết bị thông thường như tủ giữ nhiệt, bể ổn nhiệt hoặc các block giữ nhiệt. Trên thế giới đã có những công bố thiết lập phản ứng RPA trên các thiết bị tương tự như trên [97].
Zachary Austin Crannell và cộng sự (2014) đã báo cáo kết quả nghiên cứu về