Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp O. tsutsugamushi nồng độ 102 – 104 copy/p.ư được sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA đã xây dựng và quy trình Realtime PCR của bộ kit Orientia tsutsugamushi Membrane Protease gene (Primerdesign), mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần. Kết quả cho thấy quy trình RPA có khả năng phát hiện 6/6 lần lặp lại nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy trình realtime PCR (Primerdesign).
Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi
A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D – đối chứng âm/ đối chứng dương
Ngoài ra ngưỡng phát hiện của quy trình RPA còn được biết đến là không bị giới hạn, nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phát hiện sản phẩm được khuếch đại của công nghệ RPA là chỉ từ một phân tử DNA duy nhất [80].
Trong nghiên cứu của Chao và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật RPA dựa trên cả hai hình thức phát hiện với gen đích là 47 kDa đối với O. tsutsugamushi.
Ngưỡng phát hiện đạt được của thử nghiệm RPA sử dụng flouresent RPA là 100-120 copies/ phản ứng (tỷ lệ cho kết quả dương tính là 100%). Trong khi ngưỡng phát hiện của thử nghiệm RPA sử dụng Exo test khi đánh giá nồng độ là 100-120 copies/phản ứng cho kết quả 53,8% tỷ lệ dương tính. Như vậy, việc đạt được ngưỡng phát hiện 100 copies/phản ứng của nhóm nghiên cứu là tương đương với các quy trình RPA đã thực hiện cùng mục đích phát hiện O. tsutsugamushi gây bệnh sốt mò.
Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát hiện O. tsutsugamushi
A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D – đối chứng âm/ đối chứng dương
So sánh về thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình (Bảng 3.4) cho thấy quy trình RPA không những có ngưỡng phát hiệntương đương với quy trình realtime PCR mà còn cho phép phân tích kết quả nhanh hơn rất nhiều (10,12 phút) ở điều kiện đẳng nhiệt (37℃).
Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O. tsutsugamushi
Copy/p.ư
Thời gian khuếch đại trung bình Realtime PCR RPA (phút) Chu kỳ Time (phút) 104 21,5 45,01 6,57 103 25,2 52,47 9,63 102 29,8 61,6 10,12