Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình đẳng nhiệt RPA phát hiện O. tsutsugamushi, các bước thực hiện chi tiết của quy trình cụ thể như sau:
Rã đông hoàn toàn các thành phần phản ứng và mẫu DNA đã tách chiết (nếu đông) và giữ chúng ở trên đá.
Trộn đều và spin down các thành phần phản ứng để được các hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ chúng ở trên đá để có hiệu quả xét nghiệm cao nhất.
Bảng 3.3: Chuẩn bịmastermix STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 phản ứng (µl) 1 Reaction Buffer 2 X 10 2 dNTPs 25 mM 1,44 3 Nuclease-freewater 0,52 4 Probe E-mix 10 X 2 5 Mồi xuôi 15 0,72 6 Mồi ngược 15 0,72 7 Probe 10 0,2
8 Core Reaction Mix 20 X 1
9 Exo 50 X 0,4
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng 17
10 MgOAc 280 mM 1
11 Mẫu DNA 2
Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 20
Đối với các thành phần Core Reaction Mix và Exo: bổ sung lần lượt từng thành phần lên nắp tube sau đó đảo trộn lên xuống 10 lần và spin down nhanh.
Đảo trộn bằng pipet các thành phần của dung dich đệm trước khi chia 17 µl ra từng ống phản ứng 0,2 ml.
Spin down nhanh để MgOAc và mẫu DNA rơi xuống đáy ống phản ứng ngay khi bắt đầu ủ.
Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn ra. Phản ứng RPA sẽ xảy ra khi MgOAc được thêm vào ngay cả khi ở nhiệt độ phòng. Do đó, hạn chế cho MgOAc tiếp xúc với master mix khi chưa tiến hành ủ.
Cài đặt máy Genie II ở 37℃ trong 30 phút
Chuyển các ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt và bắt đầu phản ứng theo điều kiện phản ứng đã cài đặt.
Đọc kết quả
- Kết quả quy trình phát hiện O. tsutsugamushi do nhóm nghiên cứu thiết lập được xác định dựa tín hiệu huỳnh quang thu được từ hệ thống thu nhận tín hiệu huỳnh quang.
- Kiểm tra các mẫu đối chứng dương và đối chứng âm để đảm bảo kết quả xét nghiệm không phải là kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.
+ Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại của mẫu đã được chuẩn độ trước đó (mẫu chứng dương cung cấp kèm bộ kít có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại là 8 – 15 phút)
+ Mẫu chứng âm phải cho kết quả âm tính.
- Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm.