Chuẩn bị các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật khác
Các mẫu âm tính với O. tsutsugamushi (10 mẫu) là DNA tách từ máu toàn phần của người khỏe mạnh sử dụng bộ kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN). Các mẫu âm tính được thu thập tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y.
Các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò, gồm 10 chủng: Leptospira biflexa serovar Patoc, Leptospira interrogan serovar Pomona, Leptospira interrogan serovar Australis doViện Y học dự phòng Quân đội cung cấp,
Dengue virrus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabiles, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli do khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân Y cung cấp.
Phương pháp đánh giá
Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong tổng số các trường hợp không bị bệnh. Độ đặc hiệu được xác định bằng công thức sau:
Độ đặc hiệu = số ca âm tính thật
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Trình tự mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa của hầu hết các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á do nhóm nghiên cứu thiết kế:
Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi
Mồi/ probe Trình tự (5’-3’)
Mồi xuôi TAAAGTTGCATGATGGTTCAGAACTGATAGCA
Mồi ngược TATTGCAATAACCTGATCTCCTACTCTAGA
Probe 5’dATTAAAAATTAATTCTTCAGCAGCATTATCTTA-(FAM- dT)-GC-(THF)-AC-(BHQ1-dT)-TTTGGCGATTCA-3’ blocker
Kết quả đánh giá và so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen đích 47- kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á với trình tự mồi và probe trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs cho thấy các trình tự mồi xuôi và probe do nhóm nghiên cứu thiết kế là tương đồng 100% với các trình tự gen đích 47-kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á
Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của
O. tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao
và cs [38]
3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình tự mồi/ probe do nhóm nghiên cứu chế tạo được trình bày trên Hình 3.2. Kết quả cho thấy các trình tự oligos hoạt động tốt với đối chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm (khoảng 11 phút), đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ phản ứng là đặc hiệu, không có hiện tương mồi bắt cặp hay nhiễm chéo diễn ra trong quá trình phản ứng.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu
Đối chứng dươngO. tsutsugamushi: (+) (màu cam) và đối chứng âm: NTC (màu xanh)
3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA
Tối ưu điều kiện phản ứng
Dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C được khảo sát để chọn ra nhiệt độ phản ứng RPA tối ưu. Kết quả chỉ ra trong Hình 3.3 cho thấy nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37°C với thời gian thu nhận tín hiệu sớm nhất.
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)
38+ Nhiệt độ phản ứng 38℃ 11 39+ Nhiệt độ phản ứng 39℃ 11 40+ Nhiệt độ phản ứng 40℃ 12 41+ Nhiệt độ phản ứng 41℃ 12 45+ Nhiệt độ phản ứng 45℃ 12 50+ Nhiệt độ phản ứng 50℃ NA 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 45-, 50-
Đối chứng âm ở nhiệt độ phản ứng 37-41℃, 45℃ và 50℃
NA
Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Các phản ứng chứng dương cùng lượng khuôn DNA; phản ứng chứng âm không có khuôn DNA với nồng độ mồi là 0,42 µM, nồng độ probe là 0.1 µM.
Nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất của nhà sản xuất, các nhiệt độ 45 và 50℃ cũng được nhóm nghiên cứu thử nghiệm và đánh giá. Ở nhiệt độ 45℃, hoạt tính của enzyme không bị ảnh hưởng đáng kể, đối chứng dương vẫn cho tín hiệu khá sớm, tương đương với các nhiệt độ khác trong dải nhiệt độ tối ưu. Hoạt tính của các enzyme bị mất hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 50℃, đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại chứng dương giờ chỉ là tín hiệu nhiễu, không quá khác biệt so với tín hiệu chứng âm được thu nhận bởi thiết bị GenieII.
Kết quả thử nghiệm ở các nhiệt độ khác nhau với cùng một nồng độ mẫu chứng dương cho thấy, thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sớm nhất ở nhiệt độ 37°C (khoảng 10 phút). Do hạn chế về thời gian, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết bị GenieII, nhóm nghiên cứu chưa tiến hành các thử nghiệm trên các thiết bị giữ nhiệt hoặc ủ ấm thông thường. Nhưng với các kết quả nghiên cứu trên cũng cho thấy, kỹ thuật RPA hoàn toàn có thể được ứng dụng trên các thiết bị thông thường như tủ giữ nhiệt, bể ổn nhiệt hoặc các block giữ nhiệt. Trên thế giới đã có những công bố thiết lập phản ứng RPA trên các thiết bị tương tự như trên [97].
Zachary Austin Crannell và cộng sự (2014) đã báo cáo kết quả nghiên cứu về thiết lập phản ứng RPA không sử dụng thiết bị giữ nhiệt chuyên dụng [48]. Trong công bố này, nhóm tác giả đã chứng minh nhiệt độ cơ thể người và nhiệt độ môi trường ở khu vực khí hậu ấm áp (khoảng 30oC) có thể được sử dụng cho phản ứng RPA khuếch đại đẳng nhiệt bộ gen của HIV-1.
Nhiệt độ cơ thể người trung bình tại nách, bụng, túi quần và bàn tay lần lượt là 34,8 ± 0,6, 31,3 ± 1,7, 33,1 ± 0,5 và 33,4 ± 2,7 độ C. Hỗn hợp phản ứng sau khi tạo ra được ủ ấm tại các vị trí trên một cách đơn giản. Trong vòng chưa đầy ba phút, tất cả các phản ứng giả đều đạt đến nhiệt độ 31 độ C, tất cả các phản ứng RPA đều xuất hiện tín hiệu khuếch đại DNA đến mức có thể phát hiện được. Kết quả nghiên cứu cũng chứng minh, nhiệt độ cơ thể ở khu vực hố nách tương đối ổn định và đạt gần nhất với nhiệt độ được khuyến nghị cho RPA (37oC).
Tối ưu thành phần phản ứng RPA
- Tối ưu nồng độ mồi:
Kết quả tối ưu được trình bày trên Hình 3.4. Ở tất cả các nồng độ mồi, đối chứng dương đều cho tín hiệu khuếch đại tốt tương đương nhau, đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại. Ở nồng độ mồi 0,54 µM, thời gian phát hiện đối chứng dương là sớm nhất nên nhóm nghiên cứu lựa chọn 0,54 µM là nồng độ tối ưu cho phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 0.54 Nồng độ mồi 0,54 10 0.42 Nồng độ mồi 0,42 12 0.36 Nồng độ mồi 0,36 15 0.24 Nồng độ mồi 0,24 16 NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
- Tối ưu nồng độ probe
Khi thay đổi nồng độ probe theo dải nồng độ đề xuất của nhà sản xuất (0,06- 0,15µM), kết quả cho thấy nồng độ probe 0,1µM là nồng độ thấp cho tín hiệu khuếch đại sớm tương đương với các nồng độ cao khác (0,12 và 0,15µM). Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ probe 0,1µM là tối ưu và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này. Kết quả chi tiết ở hình sau:
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 0.15 Nồng độ probe 0,15 9 0.12 Nồng độ probe 0,12 9 0.1 Nồng độ probe 0,1 9 0.08 Nồng độ probe 0,08 10 0.06 Nồng độ probe 0,06 15 NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
- Tối ưu nồng độ MgOAc:
Việc tăng nồng độ MgOAc có thể làm cải thiện tốc độ phản ứng. Thật vậy, đối với nồng độ MgOAc quá thấp (12mM), tốc độ phản ứng bị giảm đi đáng kể, biểu hiện ở thời gian phát hiện tín hiệu huỳnh quang khá muộn so với các nồng độ khác (khoảng 13 phút). Khi tăng nồng độ MgOAc lên 14mM, 18mM và 20mM, thời gian phát hiện đối chứng dương thu được là tương đối sớm hơn (chưa đến 10 phút). Tuy nhiên,
không có sự khác biệt quá lớn về mặt thời gian khi thực hiện phản ứng RPA với các nồng độ MgOAc 14mM, 18mM và 20mM. Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ 14mM, cũng là nồng độ ban đầu theo đề xuất của nhà sản xuất là nồng độ tối ưu cho phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi.
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 20mM Nồng độ MgOAc 20mM 9
18mM Nồng độ MgOAc 18mM 9 14mM Nồng độ MgOAc 14mM 9 12mM Nồng độ MgOAc 12mM 13
NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã tối ưu thành công thành phần phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi, cụ thể như sau:
Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA STT Thành phần Nồng độ Đơn vị
1 Mồi 0,54 µM
2 Probe 0,10 µM
3 MgOAc 14,00 mM
Trong các thành phần tạo nên hệ đệm thích hợp cho các enzyme hoạt động, ion Mg2+ có vai trò rất quan trọng không chỉ trong liên quan đến độ đặc hiệu và khả năng khuếch đại của phản ứng, mà còn đóng vai trò kích hoạt các enzyme tái tổ hợp tham gia kéo dài chuỗi trong quá trình tổng hợp DNA. Với điều kiện nhiệt độ 37oC và không đòi hỏi một sự kiểm soát chặt chẽ về độ dao động về nhiệt, phản ứng RPA thậm chí có thể hoạt động ở trong điều kiện nhiệt độ môi trường ở những khu vực khí hậu ấm áp (khoảng 30oC). Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu trong quá trình mix trộn hỗn hợp phản ứng, đã tiến hành chuyển dung dịch MgOAc vào phần nắp của tube phản ứng, và chỉ được hòa trộn vào hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng máy spin down trước khi bước ủ nhiệt độ bắt đầu. Chi tiết kỹ thuật này cũng được các tác giả trên thế giới sử dụng nhằm đảm bảo hiệu suất của phản ứng khuếch đại, góp phần tăng độ nhạy của thử nghiệm [117].
3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình đẳng nhiệt RPA phát hiện O. tsutsugamushi, các bước thực hiện chi tiết của quy trình cụ thể như sau:
Rã đông hoàn toàn các thành phần phản ứng và mẫu DNA đã tách chiết (nếu đông) và giữ chúng ở trên đá.
Trộn đều và spin down các thành phần phản ứng để được các hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ chúng ở trên đá để có hiệu quả xét nghiệm cao nhất.
Bảng 3.3: Chuẩn bịmastermix STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 phản ứng (µl) 1 Reaction Buffer 2 X 10 2 dNTPs 25 mM 1,44 3 Nuclease-freewater 0,52 4 Probe E-mix 10 X 2 5 Mồi xuôi 15 0,72 6 Mồi ngược 15 0,72 7 Probe 10 0,2
8 Core Reaction Mix 20 X 1
9 Exo 50 X 0,4
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng 17
10 MgOAc 280 mM 1
11 Mẫu DNA 2
Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 20
Đối với các thành phần Core Reaction Mix và Exo: bổ sung lần lượt từng thành phần lên nắp tube sau đó đảo trộn lên xuống 10 lần và spin down nhanh.
Đảo trộn bằng pipet các thành phần của dung dich đệm trước khi chia 17 µl ra từng ống phản ứng 0,2 ml.
Spin down nhanh để MgOAc và mẫu DNA rơi xuống đáy ống phản ứng ngay khi bắt đầu ủ.
Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn ra. Phản ứng RPA sẽ xảy ra khi MgOAc được thêm vào ngay cả khi ở nhiệt độ phòng. Do đó, hạn chế cho MgOAc tiếp xúc với master mix khi chưa tiến hành ủ.
Cài đặt máy Genie II ở 37℃ trong 30 phút
Chuyển các ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt và bắt đầu phản ứng theo điều kiện phản ứng đã cài đặt.
Đọc kết quả
- Kết quả quy trình phát hiện O. tsutsugamushi do nhóm nghiên cứu thiết lập được xác định dựa tín hiệu huỳnh quang thu được từ hệ thống thu nhận tín hiệu huỳnh quang.
- Kiểm tra các mẫu đối chứng dương và đối chứng âm để đảm bảo kết quả xét nghiệm không phải là kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.
+ Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại của mẫu đã được chuẩn độ trước đó (mẫu chứng dương cung cấp kèm bộ kít có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại là 8 – 15 phút)
+ Mẫu chứng âm phải cho kết quả âm tính.
- Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm.
3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA
Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp O. tsutsugamushi nồng độ 102 – 104 copy/p.ư được sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA đã xây dựng và quy trình Realtime PCR của bộ kit Orientia tsutsugamushi Membrane Protease gene (Primerdesign), mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần. Kết quả cho thấy quy trình RPA có khả năng phát hiện 6/6 lần lặp lại nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy trình realtime PCR (Primerdesign).
Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi
A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D – đối chứng âm/ đối chứng dương
Ngoài ra ngưỡng phát hiện của quy trình RPA còn được biết đến là không bị giới hạn, nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phát hiện sản phẩm được khuếch đại của công nghệ RPA là chỉ từ một phân tử DNA duy nhất [80].
Trong nghiên cứu của Chao và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật RPA dựa trên cả hai hình thức phát hiện với gen đích là 47 kDa đối với O. tsutsugamushi.
Ngưỡng phát hiện đạt được của thử nghiệm RPA sử dụng flouresent RPA là 100-120 copies/ phản ứng (tỷ lệ cho kết quả dương tính là 100%). Trong khi ngưỡng phát hiện của thử nghiệm RPA sử dụng Exo test khi đánh giá nồng độ là 100-120 copies/phản ứng cho kết quả 53,8% tỷ lệ dương tính. Như vậy, việc đạt được ngưỡng phát hiện 100 copies/phản ứng của nhóm nghiên cứu là tương đương với các quy trình RPA đã thực hiện cùng mục đích phát hiện O. tsutsugamushi gây bệnh sốt mò.
Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát hiện O. tsutsugamushi
A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D – đối chứng âm/ đối chứng dương
So sánh về thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình (Bảng 3.4) cho thấy quy trình RPA không những có ngưỡng phát hiệntương đương với quy trình realtime PCR mà còn cho phép phân tích kết quả nhanh hơn rất nhiều (10,12 phút) ở điều kiện đẳng nhiệt (37℃).
Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O. tsutsugamushi
Copy/p.ư
Thời gian khuếch đại trung bình Realtime PCR RPA (phút) Chu kỳ Time (phút) 104 21,5 45,01 6,57 103 25,2 52,47 9,63 102 29,8 61,6 10,12
3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (PrimerDesign) (PrimerDesign)
Đánh giá trên các mẫu dương tính giả định các nồng độ khác nhau (tp1-tp10) cho thấy quy trình RPA có khả năng phát hiện 10/10 mẫu bệnh phẩm dương tính giả định, tương đương với độ nhạy 100% (Hình 3.9a). Độ nhạy này là tương đương với quy trình realtime PCR bộ kit thương mại hiện hành (PrimerDesign) (Hình 3.9b)