(PrimerDesign)
Đánh giá trên các mẫu dương tính giả định các nồng độ khác nhau (tp1-tp10) cho thấy quy trình RPA có khả năng phát hiện 10/10 mẫu bệnh phẩm dương tính giả định, tương đương với độ nhạy 100% (Hình 3.9a). Độ nhạy này là tương đương với quy trình realtime PCR bộ kit thương mại hiện hành (PrimerDesign) (Hình 3.9b)
Trước đó, đã có nhiều công bố trên thế giới sử dụng các công nghệ khác nhau phát hiện O. tsutsugamushi. Vào năm 2008 và 2012, các quy trình LAMP đặc hiệu gen đích groEL phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò đã được xây dựng thành công tuy nhiên độ nhạy đạt được chưa cao [32, 111]. Các quy trình PCR, multiplex PCR đặc hiệu gen đích groEL cũng đã được thiết lập, độ nhạy quy trình đạt 94,5% và 86,5% [131]. Như vậy, độ nhạy của quy trình RPA do nhóm nghiên cứu thiết lập là tương đương với các quy trình sử dụng các công nghệ khuếch đại acid nucleic khác nhau phát hiện O. tsutsugamushi đã được công bố.
Tính đến thời điểm hiện tại, mới chỉ có một quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi được thiết lập và đánh giá bởi Chien-Chung Chao và cs vào năm 2015 [41, 95]. Tuy nhiên, độ nhạy đạt được của nghiên cứu khi đánh giá trên các mẫu DNA tách chiết từ nhiều nguồn gốc khác nhau, bao gồm mẫu bệnh phẩm bệnh nhân sốt mò thu thập tại một bệnh viện ở Thái Lan, các mẫu máu của chuột được gây nhiễm O. tsutsugamushi là 80%, độ nhạy này là chưa cao. Độ nhạy của quy trình RPA có thể bị
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thiết kế mồi, probe; quy trình lấy mẫu, bảo quản; tách chiết DNA hay cũng có thể bị ảnh hưởng bởi quá trình thực hiện quy trình phản ứng RPA,… Trong nghiên cứu của Chien-Chung Chao và cs, các tác giả thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa của chủng chuẩn Orientia tsutsugamushi, tuy nhiên trình tự gen đích 47-kDa lại có tính đa hình tương đối cao ở các khu vực địa lý khác nhau, dẫn đến các trình tự do các tác giả thiết kế bao gồm probe có tới 02 vị trí mismatches, trong đó có 1 vị trí ở gần đầu 5’ và 1 vị trí ở gần đầu 3’ (Hình 3.1b), trình tự mồi xuôi có 1 vị trí mismatches ở gần đầu 3’ (Hình 3.1a) so với trình tự gen đích 47- kDa của các chủng O. tsutsugamushi được phân lập tại khu vực Đông Nam Á. Trong khi đó, nếu có nhiều hơn một điểm không bắt cặp ở đầu 3’ của mồi hoặc ba điểm không bắt cặp ở cả hai đầu 5’ và 3’ hoặc trong trung tâm của mồi thì sẽ làm suy giảm khả năng khuếch đại và ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng [54]. Trong nghiên cứu này, trình tự mồi xuôi và probe do nhóm nghiên cứu thiết kế có khả năng bắt cặp đặc hiệu và bổ sung hoàn toàn với hầu hết các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và các nước trong khu vực nên độ nhạy đạt được là khá cao (100%).
Hình 3.9b. Quy trình Realtime PCR khuếch đại các mẫu dương tính giả định
Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10)
Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và điều kiện tiếp cận với bệnh nhân sốt mò nên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng dương tính với O. tsutsugamushi chưa được đánh giá trong nghiên cứu. Cần thiết phải tiến hành thử nghiệm trên các mẫu máu của bệnh nhân đã được xác chẩn sốt mò trên lâm sàng bằng các phương pháp khác với số lượng mẫu lớn hơn và tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau. Việc này không chỉ có ý nghĩa trong việc đánh giá ngưỡng phát hiện hay độ nhạy thực sự của quy trình, mà còn đánh giá thời điểm thích hợp nhất trên lâm sàng nhằm thu thập mẫu bệnh phẩm cũng như các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau.