Tối ưu điều kiện phản ứng
Dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C được khảo sát để chọn ra nhiệt độ phản ứng RPA tối ưu. Kết quả chỉ ra trong Hình 3.3 cho thấy nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37°C với thời gian thu nhận tín hiệu sớm nhất.
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)
38+ Nhiệt độ phản ứng 38℃ 11 39+ Nhiệt độ phản ứng 39℃ 11 40+ Nhiệt độ phản ứng 40℃ 12 41+ Nhiệt độ phản ứng 41℃ 12 45+ Nhiệt độ phản ứng 45℃ 12 50+ Nhiệt độ phản ứng 50℃ NA 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 45-, 50-
Đối chứng âm ở nhiệt độ phản ứng 37-41℃, 45℃ và 50℃
NA
Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Các phản ứng chứng dương cùng lượng khuôn DNA; phản ứng chứng âm không có khuôn DNA với nồng độ mồi là 0,42 µM, nồng độ probe là 0.1 µM.
Nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất của nhà sản xuất, các nhiệt độ 45 và 50℃ cũng được nhóm nghiên cứu thử nghiệm và đánh giá. Ở nhiệt độ 45℃, hoạt tính của enzyme không bị ảnh hưởng đáng kể, đối chứng dương vẫn cho tín hiệu khá sớm, tương đương với các nhiệt độ khác trong dải nhiệt độ tối ưu. Hoạt tính của các enzyme bị mất hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 50℃, đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại chứng dương giờ chỉ là tín hiệu nhiễu, không quá khác biệt so với tín hiệu chứng âm được thu nhận bởi thiết bị GenieII.
Kết quả thử nghiệm ở các nhiệt độ khác nhau với cùng một nồng độ mẫu chứng dương cho thấy, thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sớm nhất ở nhiệt độ 37°C (khoảng 10 phút). Do hạn chế về thời gian, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết bị GenieII, nhóm nghiên cứu chưa tiến hành các thử nghiệm trên các thiết bị giữ nhiệt hoặc ủ ấm thông thường. Nhưng với các kết quả nghiên cứu trên cũng cho thấy, kỹ thuật RPA hoàn toàn có thể được ứng dụng trên các thiết bị thông thường như tủ giữ nhiệt, bể ổn nhiệt hoặc các block giữ nhiệt. Trên thế giới đã có những công bố thiết lập phản ứng RPA trên các thiết bị tương tự như trên [97].
Zachary Austin Crannell và cộng sự (2014) đã báo cáo kết quả nghiên cứu về thiết lập phản ứng RPA không sử dụng thiết bị giữ nhiệt chuyên dụng [48]. Trong công bố này, nhóm tác giả đã chứng minh nhiệt độ cơ thể người và nhiệt độ môi trường ở khu vực khí hậu ấm áp (khoảng 30oC) có thể được sử dụng cho phản ứng RPA khuếch đại đẳng nhiệt bộ gen của HIV-1.
Nhiệt độ cơ thể người trung bình tại nách, bụng, túi quần và bàn tay lần lượt là 34,8 ± 0,6, 31,3 ± 1,7, 33,1 ± 0,5 và 33,4 ± 2,7 độ C. Hỗn hợp phản ứng sau khi tạo ra được ủ ấm tại các vị trí trên một cách đơn giản. Trong vòng chưa đầy ba phút, tất cả các phản ứng giả đều đạt đến nhiệt độ 31 độ C, tất cả các phản ứng RPA đều xuất hiện tín hiệu khuếch đại DNA đến mức có thể phát hiện được. Kết quả nghiên cứu cũng chứng minh, nhiệt độ cơ thể ở khu vực hố nách tương đối ổn định và đạt gần nhất với nhiệt độ được khuyến nghị cho RPA (37oC).
Tối ưu thành phần phản ứng RPA
- Tối ưu nồng độ mồi:
Kết quả tối ưu được trình bày trên Hình 3.4. Ở tất cả các nồng độ mồi, đối chứng dương đều cho tín hiệu khuếch đại tốt tương đương nhau, đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại. Ở nồng độ mồi 0,54 µM, thời gian phát hiện đối chứng dương là sớm nhất nên nhóm nghiên cứu lựa chọn 0,54 µM là nồng độ tối ưu cho phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 0.54 Nồng độ mồi 0,54 10 0.42 Nồng độ mồi 0,42 12 0.36 Nồng độ mồi 0,36 15 0.24 Nồng độ mồi 0,24 16 NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
- Tối ưu nồng độ probe
Khi thay đổi nồng độ probe theo dải nồng độ đề xuất của nhà sản xuất (0,06- 0,15µM), kết quả cho thấy nồng độ probe 0,1µM là nồng độ thấp cho tín hiệu khuếch đại sớm tương đương với các nồng độ cao khác (0,12 và 0,15µM). Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ probe 0,1µM là tối ưu và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này. Kết quả chi tiết ở hình sau:
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 0.15 Nồng độ probe 0,15 9 0.12 Nồng độ probe 0,12 9 0.1 Nồng độ probe 0,1 9 0.08 Nồng độ probe 0,08 10 0.06 Nồng độ probe 0,06 15 NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
- Tối ưu nồng độ MgOAc:
Việc tăng nồng độ MgOAc có thể làm cải thiện tốc độ phản ứng. Thật vậy, đối với nồng độ MgOAc quá thấp (12mM), tốc độ phản ứng bị giảm đi đáng kể, biểu hiện ở thời gian phát hiện tín hiệu huỳnh quang khá muộn so với các nồng độ khác (khoảng 13 phút). Khi tăng nồng độ MgOAc lên 14mM, 18mM và 20mM, thời gian phát hiện đối chứng dương thu được là tương đối sớm hơn (chưa đến 10 phút). Tuy nhiên,
không có sự khác biệt quá lớn về mặt thời gian khi thực hiện phản ứng RPA với các nồng độ MgOAc 14mM, 18mM và 20mM. Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ 14mM, cũng là nồng độ ban đầu theo đề xuất của nhà sản xuất là nồng độ tối ưu cho phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi.
Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút) 20mM Nồng độ MgOAc 20mM 9
18mM Nồng độ MgOAc 18mM 9 14mM Nồng độ MgOAc 14mM 9 12mM Nồng độ MgOAc 12mM 13
NTC Đối chứng âm NA
Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã tối ưu thành công thành phần phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi, cụ thể như sau:
Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA STT Thành phần Nồng độ Đơn vị
1 Mồi 0,54 µM
2 Probe 0,10 µM
3 MgOAc 14,00 mM
Trong các thành phần tạo nên hệ đệm thích hợp cho các enzyme hoạt động, ion Mg2+ có vai trò rất quan trọng không chỉ trong liên quan đến độ đặc hiệu và khả năng khuếch đại của phản ứng, mà còn đóng vai trò kích hoạt các enzyme tái tổ hợp tham gia kéo dài chuỗi trong quá trình tổng hợp DNA. Với điều kiện nhiệt độ 37oC và không đòi hỏi một sự kiểm soát chặt chẽ về độ dao động về nhiệt, phản ứng RPA thậm chí có thể hoạt động ở trong điều kiện nhiệt độ môi trường ở những khu vực khí hậu ấm áp (khoảng 30oC). Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu trong quá trình mix trộn hỗn hợp phản ứng, đã tiến hành chuyển dung dịch MgOAc vào phần nắp của tube phản ứng, và chỉ được hòa trộn vào hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng máy spin down trước khi bước ủ nhiệt độ bắt đầu. Chi tiết kỹ thuật này cũng được các tác giả trên thế giới sử dụng nhằm đảm bảo hiệu suất của phản ứng khuếch đại, góp phần tăng độ nhạy của thử nghiệm [117].