Chúng tôi sử dụng 10 chủng vi sinh vật (đã mô tả) và 10 mẫu âm tính với
O. tsutsugamushi (nhóm người khỏe mạnh) để đánh giá độ đặc hiệu của quy trình RPA đã thiết lập và quy trình realtime PCR (PrimerDesign).
Hình 3.10a. Đánh giá trên các mẫu âm tính
Hình 3.10b. Đánh giá trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò
Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp
trong chẩn đoán phân biệt sốt mò
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò và các mẫu âm tính cho thấy kỹ thuật có độ đặc hiệu cao: chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm, chứng âm không có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ quá trình phản ứng không có nhiễm chéo hay hiện tượng
mồi bắt cặp, các ống bổ sung DNA các chủng vi sinh vật khác không cho tín hiệu khuếch đại (Hình 3.10). Vậy độ đặc hiệu của kỹ thuật realtime PCR khuếch đại DNA
O. tsutsugamushi là 20/(20+0) = 1, hay có thể nhận định rằng độ đặc hiệu kỹ thuật bộ kit thương mại khi đánh giá trên các mẫu âm tính với O. tsutsugamushi là 100%.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA được trình bày trên HÌnh 3.11. Quy trình RPA đã xây dựng không phát hiện bất kỳ mẫu nào trong 10 mẫu âm tính với O. tsutsugamushi và trên 10 mẫu DNA các chủng vi sinh vật khác thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò, tương đương với độ đặc hiệu 100%. Quy trình realtime PCR (PrimerDesign) cũng cho kết quả đánh giá độ đặc hiệu tương đương (Bảng 3.5).
Hình 3.11a. Đánh giá trên các mẫu âm tính (tn1-tn10) và một số chủng vi sinh vật khác (b1-b4)
Hình 3.11b. Đánh giá trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò (b5-b10)
Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA
Orientia tsutsugamushi trên các mẫu âm tínhvà các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt
Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình Mẫu đánh giá Độ đặc hiệu (%)
Realtime PCR RPA
Đánh giá trên mẫu bệnh phẩm âm tính
với Orientia tsutsugamushi 100 100
Đánh giá trên các mẫu vi sinh vật có
thể gây triệu chứng tương tự. 100 100
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát hiện O. tsutsugamushi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao với các chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Quy trình RPA đã thiết lập được thực hiện ở điều kiện đẳng nhiệt 37℃, trên thiết bị máy Genie® II chỉ
trong vòng 30 phút mà không cần sử dụng đến thiết bị luân nhiệt tinh vi nào với giá thành cao như PCR. Nếu quy trình realtime PCR cần ít nhất tới 2 giờ để phân tích kết quả thì quy trình RPA chỉ cần 30 phút để đưa ra kết quả chính xác cho một mẫu cần phân tích, rút ngắn đáng kể thời gian phát hiện tác nhân gây bệnh.
Mặc dù quy trình RPA được tối ưu trong nghiên cứu này mới ở mức phát hiện định tính mà chưa phải là định lượng, tuy nhiên với ngưỡng phát hiện đạt được rất tốt và độ nhạy, độ đặc hiệu cao gợi ý rằng có thể sử dụng quy trình này ở các điều kiện thực tế mà không cần trải qua các công đoạn làm giàu mẫu bệnh phẩm nhằm tăng độ nhạy như các kỹ thuật khuếch đại gen dựa trên phản ứng luân nhiệt đang sử dụng. Với thời gian phát hiện nhanh chóng và các thông số kỹ thuật tương đương với bộ kit hiện hành, quy trình đẳng nhiệt đã thiết lập hứa hẹn là công cụ chẩn đoán hữu hiệu có khả năng ứng dụng trong các phòng thí nghiệm được trang bị hiện đại, phòng thí nghiệm di động hoặc khu vực có điềukiện hạn chế về trang thiết bị cơ sở hạ tầng giúp chẩn đoán tác nhân gây bệnh sốt mò.
KẾT LUẬN
1. Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh và chính xác O. tsutsugamushi trong thời gian ngắn (chỉ 30 phút) với ngưỡng phát hiện 100 copy/p.ư.
2. Quy trình RPA đã thiết lập có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (100%)
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm thực địa, đánh giá quy trình RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi đã thiết lập trên các mẫu lâm sàng với quy mô lớn
2. Ứng dụng công nghệ RPA vào phát hiện các mầm bệnh truyền nhiễm cũng như các mầm bệnh khác yêu cầu về thời gian chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm chi phí và mang lại hiệu quả cao
TÀI LIỆU THAM KHẢO
* Tài liệu Tiếng Việt
1. Cục Y tế Dự phòng (2016), Bệnh sốt mò
2. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi Kuratsuji (2006), "Biểu hiện xuất huyết và tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân sốt mò".Tạp chí: Nghiên cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 45, số 5: tr. 42-47. 3. Bùi Trọng Chiến, Philip Buchy, Trịnh Thị Xuân Mai, Lê Viết Lô, Ngô Thị Quyết, Ngô Lê Minh Tâm, Viên Quang Mai, Nguyễn Bảo Triệu (2014), "Một số đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học bệnh sốt mò do Orientia tsutsugamushi ở miền trung Việt Nam, giai đoạn 2009 - 2010", Tạp chí Y học dự phòng, tập XXIV, số 2: tr. 9-15.
4. Cao Văn Sung, Đặng Huy Huỳnh, Bùi Kính (1980), Những loài gặm nhấm ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật
5. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi Kuratsuji (2006), "Đặc điểm dịch tễ sốt mò các trường hợp điều trị tại Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới, 2001 - 2003", Tạp chí Y học dự phòng, tập XVI, số 1(79): tr. 59-64.
6. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thuỷ, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi Kuratsuji (2006), "Một số biểu hiện thần kinh trong sốt mò", Tạp chí Nghiên cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 43, số 4: tr. 25-30.
7. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi Kuratsuji (2006), "Biểu hiện xuất huyết và tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân sốt mò", Tạp chí: Nghiên cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 45, số 5: tr. 42-47. 8. Nguyễn Văn Châu (1994), Khu hệ mò-họ trombiculidae (acariformes) ở Việt
Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật
9. Nguyễn Văn Châu (1997), Phân loài mò (Acariformes, Trombiculidae) ở Việt Nam, Nhà xuất bản Y học
10. Nguyễn Văn Châu (2005), "Ba loài mò mới (Acariformes, Trombiculidae) ký sinh trên thú, chim và bò sát ở Việt Nam", Tạp chí Sinh học, 27 (2), tr. 8-15.
11. Đoàn Trọng Tuyên, Vũ Chiến Thắng, Nguyễn Minh Tiếp, Nguyễn Viết Sự, and Trần Quang Nguyên & cs (2008), "Khảo sát mức độ lưu hành bệnh sốt mò tại một số khu vực thuộc Tuyên Quang, Khánh Hòa và Kon Tum", Tạp chí Y học quân sự, tr.30-34.
12. Lê Hồng Quang, Trần Huy Hoàng, Hồ Lê Cẩm Nhung (2012), "Nghiên cứu đặc điểm bệnh sốt mò và đánh giá hiệu quả điều trị bằng Cloramphenicol", Tạp chí Y học Việt Nam, số đặc biệt 2012: tr.84-90.
13. Lê Thị Hồng Vân, Hà Minh Thư, Nguyễn Văn Châu (2014), Tình hình sốt mò tỉnh Yên Bái năm 2014, Báo cáo khoa học toàn văn - Hội nghị ký sinh trùng toàn quốc, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 172-179.
14. Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Minh, Trịnh Văn Toàn, Võ Viết Cường (2017), "Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli", Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, tr.67-74.
15. Nguyễn Bá Hành, Trần Huy Hoàng, Dương Tuấn Linh và cs (2009), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và điều trị sốt mò tại Bệnh viện 87, Nha Trang - Khánh Hòa năm 2008 - 2009", Tạp chí Dược lâm sàng 108, số 10/2009: tr. 111-118.
16. Nguyễn Văn Châu, Nguyễn Mạnh Hùng, Hồ Đình Trung (2011), Thực hành kỹ thuật chân đốt y học, NXB Y học, Hà Nội
17. Nguyễn Văn Châu, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Sĩ Hiển (2007), Động Vật chí Việt Nam - Fauna of Vietnam, 16: Họ mò đỏ Trombiculidae, Bộ Bọ chét Siphonaptera, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
18. Nguyễn Văn Châu, Phùng Xuân Bích, Nguyễn Thị Kha, Dương Thị Mùi (2005),
Tìm hiểu phân bố các loài mò (Trombiculidae) liên quan đến sự phân bố bệnh sốt mò (Tsutsugamushi ) ở một số địa phương thuộc tỉnh Quảng Ninh, Công trình nghiên cứu khoa học, Báo cáo tại Hội nghị khoa học toàn quốc chuyên ngành Sốt rét - Ký sinh trùng -Côn trùng, giai đoạn 2001-2005, Nhà xuất bản Y học,tr.267-279.
19. Nguyễn Văn Châu, Trần Thanh Dương (2016), Tài liệu định loại ve (Ixodida: Ixodoidea), Mò (Prostigmata: Trombiculidae), Mạt (Mesostigmat: Gammasoidea) thường gặp ở Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội
20. Nguyễn Văn Châu, Trương Sĩ Niêm và cs (2001), Khảo sát mò và bệnh sốt mò (Tsutsugamushi) tại một số điểm thuộc tỉnh Bắc Giang, Kỷ yếu Công trình Nghiên cứu khoa học (1996 - 2000), Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, tr. 538-546.
21. Nguyễn Văn Tình, Phạm Thị Hà Giang, Trịnh Văn Toàn, Dương Tuấn Linh, Võ Viết Cường (2017), "Đặc điểm di truyền phân tử của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò ở một số tỉnh phía Bắc", Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, số 13: tr. 59-66.
22. Nguyễn Văn Tuấn, Vũ Đức Chính, Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Văn Dũng, Trần Văn Thanh (2017), Thành phần loài, mật độ mò và tình hình bệnh nhân sốt mò tại một số xã thuộc huyện Mù Căng Chải, huyện Văn Chấn tỉnh Yên Bái năm 2016, Báo cáo khoa học Hội nghị Côn trùng học Quốc gia lần thứ IX, tr. 1004- 1010.
23. Nguyễn Xuân Quang, Đỗ Công Tấn (2011), Nghiên cứu thành phần loài, mật độ ký sinh của mò Trombiculidae) trên thú gặm nhấm ở các sinh cảnh rừng tự nhiên, rừng trồng tại hai tỉnh Quảng Ngãi và Thừa Thiên – Huế, Báo cáo khoa học Hội nghị Ký sinh trùng lần thứ 38, NXB Y học, tập 2, tr. 207-214.
24. Nguyễn Duy Quyền (2002), Đặc điểm sinh thái vùng xảy ra một số bệnh lưu hành liên quan đến sức khỏe của quân và dân trên 4 đảo tỉnh Quảng Ninh (1990- 1999), Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
25. Phạm Thị Thanh Thủy (2007), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh sốt mò, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội. 26. Cục Y tế Dự phòng và Môi trường (2009), "Bệnh sốt mò", Cẩm nang phòng,
27. Lê Võ Định Tường (1989), Một số thú nhỏ trong sinh thái - dịch học các bệnh dịch hạch và sốt mò ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ khoa học y dược, Học viện Quân y
* Tài liệu Tiếng Anh
28. Alberts, B. M. and L. Frey, (1970),"T4 bacteriophage gene 32: a structural protein in the replication and recombination of DNA". Nature, 227(5265): p. 1313-8.
29. Amano, K., A. Tamura, N. Ohashi, H. Urakami, S. Kaya, and K. Fukushi, (1987),"Deficiency of peptidoglycan and lipopolysaccharide components in Rickettsia tsutsugamushi".Infect Immun, 55(9): p. 2290-2.
30. Atwal, S., S. Giengkam, S. Chaemchuen, J. Dorling, N. Kosaisawe, M. VanNieuwenhze, S. Sampattavanich, P. Schumann, and J. Salje, (2017),"Evidence for a peptidoglycan-like structure in Orientia tsutsugamushi".Mol Microbiol, 105(3): p. 440-452.
31. Bianchi, M., B. Riboli, and G. Magni, (1985),"E. coli recA protein possesses a strand separating activity on short duplex DNAs".EMBO J, 4(11): p. 3025- 30.
32. Blacksell, Stuart D, Daniel H Paris, Wirongrong Chierakul, Vanaporn Wuthiekanun, Achara Teeratakul, Pacharee Kantipong, and Nicholas PJ Day, (2012),"Prospective evaluation of commercial antibody-based rapid tests in combination with a loop-mediated isothermal amplification PCR assay for detection of Orientia tsutsugamushi during the acute phase of scrub typhus infection".Clin. Vaccine Immunol., 19(3): p. 391-395.
33. Blanc, G., M. Ngwamidiba, H. Ogata, P. E. Fournier, J. M. Claverie, and D. Raoult, (2005),"Molecular evolution of rickettsia surface antigens: evidence of positive selection".Mol Biol Evol, 22(10): p. 2073-83.
34. Boyle, J. M. and N. Symonds, (1969),"Radiation-sensitive mutants of T4D. I. T4y: a new radiation-sensitive mutant; effect of the mutation on radiation survival, growth and recombination".Mutat Res, 8(3): p. 431-9.
35. Bozeman, F. M. and B. L. Elisberg, (1963),"Serological diagnosis of scrub typhus by indirect immunofluorescence".Proc Soc Exp Biol Med, 112: p. 568- 73.
36. cambio, Lab Reagents: Smart Buffers and Reagents, https://www.cambio.co.uk/24/1283/77/products/potassiumacetate/#tab-2, (accessed July 27th, 2018)".
37. Cardwell, M. M. and J. J. Martinez, (2009),"The Sca2 autotransporter protein from Rickettsia conorii is sufficient to mediate adherence to and invasion of cultured mammalian cells".Infect Immun, 77(12): p. 5272-80.
38. Chan, Y. G., M. M. Cardwell, T. M. Hermanas, T. Uchiyama, and J. J. Martinez, (2009),"Rickettsial outer-membrane protein B (rOmpB) mediates bacterial invasion through Ku70 in an actin, c-Cbl, clathrin and caveolin 2- dependent manner".Cell Microbiol, 11(4): p. 629-44.
39. Chandu, D., S. Paul, M. Parker, Y. Dudin, J. King-Sitzes, T. Perez, D. W. Mittanck, M. Shah, K. C. Glenn, and O. Piepenburg, (2016),"Development of a Rapid Point-of-Use DNA Test for the Screening of Genuity(R) Roundup Ready 2 Yield(R) Soybean in Seed Samples". Biomed Res Int, 2016: p. 3145921.
40. Chanta, C. and P. Phloenchaiwanit, (2015),"Randomized Controlled Trial of Azithromycin versus Doxycycline or Chloramphenicol for Treatment of Uncomplicated Pediatric Scrub Typhus".J Med Assoc Thai, 98(8): p. 756-60. 41. Chao, C. C., T. Belinskaya, Z. Zhang, and W. M. Ching, (2015),"Development of Recombinase Polymerase Amplification Assays for Detection of Orientia tsutsugamushi or Rickettsia typhi".PLoS Negl Trop Dis, 9(7): p. e0003884.
42. Chao, Chien-Chung, Tatyana Belinskaya, Zhiwen Zhang, and Wei-Mei Ching, (2015),"Development of recombinase polymerase amplification assays for detection of Orientia tsutsugamushi or Rickettsia typhi". PLoS neglected tropical diseases, 9(7): p. e0003884.
43. Chen, Y., M. Gotte, J. Liu, and P. W. Park, (2008),"Microbial subversion of heparan sulfate proteoglycans".Mol Cells, 26(5): p. 415-26.
44. Cho, B. A., N. H. Cho, S. Y. Seong, M. S. Choi, and I. S. Kim, (2010),"Intracellular invasion by Orientia tsutsugamushi is mediated by integrin signaling and actin cytoskeleton rearrangements". Infect Immun,
78(5): p. 1915-23.
45. Cho, N. H., H. R. Kim, J. H. Lee, S. Y. Kim, J. Kim, S. Cha, S. Y. Kim, A. C. Darby, H. H. Fuxelius, J. Yin, J. H. Kim, J. Kim, S. J. Lee, Y. S. Koh, W. J. Jang, K. H. Park, S. G. Andersson, M. S. Choi, and I. S. Kim, (2007),"The Orientia tsutsugamushi genome reveals massive proliferation of conjugative type IV secretion system and host-cell interaction genes".Proc Natl Acad Sci U S A, 104(19): p. 7981-6.
46. Chomvarin, C., W. Namwat, S. Wongwajana, M. Alam, K. Thaew-Nonngiew, A. Sinchaturus, and C. Engchanil, (2007),"Application of duplex-PCR in rapid and reliable detection of toxigenic Vibrio cholerae in water samples in Thailand".J Gen Appl Microbiol, 53(4): p. 229-37.
47. Chu, H., J. H. Lee, S. H. Han, S. Y. Kim, N. H. Cho, I. S. Kim, and M. S. Choi, (2006),"Exploitation of the endocytic pathway by Orientia tsutsugamushi in nonprofessional phagocytes".Infect Immun, 74(7): p. 4246-53.
48. Crannell, Z. A., B. Rohrman, and R. Richards-Kortum, (2014),"Equipment- free incubation of recombinase polymerase amplification reactions using body heat".PLoS One, 9(11): p. e112146.
49. Craw, Pascal and Wamadeva Balachandran, (2012),"Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review". Lab Chip, 12(14): p. 2469-2486.
50. Creatine kinase, https://en.wikipedia.org/wiki/Creatine_ kinase, (accessed Oct 4, 2018)".
51. Curtis, K. A., D. L. Rudolph, and S. M. Owen, (2009),"Sequence-specific detection method for reverse transcription, loop-mediated isothermal amplification of HIV-1".J Med Virol, 81(6): p. 966-72.
52. Dabo, S. M., A. W. Confer, B. E. Anderson, and S. Gupta, (2006),"Bartonella henselae Pap31, an extracellular matrix adhesin, binds the fibronectin repeat III13 module".Infect Immun, 74(5): p. 2513-21.
53. Daher, R. K., G. Stewart, M. Boissinot, and M. G. Bergeron, (2016),"Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications".Clin Chem, 62(7): p. 947-58.
54. Daher, Rana K, Gale Stewart, Maurice Boissinot, Dominique K Boudreau, and Michel G Bergeron, (2015),"Influence of sequence mismatches on the specificity of recombinase polymerase amplification technology". Molecular and cellular probes, 29(2): p. 116-121.