Trong dịch chiết thô thu đƣợc sau khi cảm ứng IPTG, protein còn lẫn nhiều tạp chất, vì vậy cần tinh sạch để thu đƣợc protein mong muốn với độ tinh sạch cao phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Theo thiết kế vector biểu hiện pET22(b+), khi protein SEB đƣợc tổng hợp sẽ có đuôi His-tag với 6 acid amin histidine liên tục ở đầu C. Phƣơng pháp tinh sạch bằng cột Ni-NTA dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazole của histidine. Khi các acid amin histidine ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Trên cơ sở đó, protein tái tổ hợp do gen seb534 mã hóa sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken. Các phân tử protein trong tế bào đƣợc tổng hợp ra do không có đuôi His-tag sẽ không gắn đƣợc với ion Ni2+. Protein tái tổ hợp đƣợc giữ lại trên cột sẽ đƣợc tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazole thích hợp. Protein SEB tồn tại ở dạng không tan trong nƣớc mà chỉ tan
đƣợc trong môi trƣờng biến tính điển hình nhƣ môi trƣờng có urea 5 M. Vì vậy, protein SEB đƣợc tinh sạch từ dịch protein tổng số của tế bào chủ E. coli
BL21(DE3) trong điều kiện đệm có chứa urea 5 M. Việc thu mẫu đƣợc tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein SEB bắt đầu tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào. Trong quá trình tinh sạch và thu mẫu protein SEB, chúng tôi đã tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trƣớc và sau tinh sạch trên gel polyacrylamide 12%. Các phân tử protein đƣợc xử lý bằng SDS và mecarpthanol, chúng bị phá vỡ cấu trúc bậc 2 và bậc 4 trở thành dạng phân tử polymer cấu trúc bậc 1. Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân tử trở nên tích điện âm đồng đều hơn. Mecarthanol làm giảm các liên kết disulphit hình thành giữa các tiểu phần cysteine. Do vậy, sự phân tách trên gel chỉ còn phụ thuộc vào trọng lƣợng và kích thƣớc phân tử protein.
Sản phẩm tinh sạch tinh sạch protein SEB534 đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và đƣợc thể hiện trên hình 3.16.
Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh sạch
M: Thang chuẩn protein; 1: Protein SEB sau tinh sạch;
2: Phân đoạn dịch qua cột với đệm rửa; 3: Phân đoạn dịch phá sau khi chảy qua cột
Kết quả điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh sạch cho thấy: ở giếng 1, sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh sạch chỉ cho một
băng đậm, duy nhất với khối lƣợng phân tử khoảng 22 kDa đúng với kích thƣớc tính toán trên lý thuyết. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tinh sạch thành công protein SEB534 ở dạng tự nhiên với độ tinh sạch khá cao, quy trình tinh sạch qua cột ái lực đối với SEB là phù hợp.
Cùng với việc biểu hiện và tinh sạch thành công SEB534, nhóm nghiên cứu thuộc đề tài KC.04.14/11-15 do Nghiêm Ngọc Minh làm chủ nhiệm cũng đã tiến hành nghiên cứu biểu hiện gen seb có kích thƣớc 720 bp và tinh sạch protein SEB720. Kháng nguyên tái tổ hợp SEB534 và SEB720 sẽ đƣợc tiến hành kiểm tra độc tính và kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để đƣa ra lựa chọn tốt nhất cho việc sử dụng kháng nguyên khối lƣợng 22 kDa hay 28 kDa cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố SEB do tụ cầu vàng gây ra.
KẾT LUẬN
1. Đã nhân dòng và xác định trình tự của gen seb534 từ chủng tụ cầu vàng S. aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên.
2. Đã thiết kế đƣợc vector pET22b(+) biểu hiện gen seb534 mã hóa cho kháng nguyên SEB.
3. Đã biểu hiện và tối ƣu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp SEB534 trong chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) với nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ.
4. Đã tinh sạch thành công protein tái tổ hợp SEB534.
KIẾN NGHỊ
1. Xác định nồng độ protein tái tổ hợp SEB534 sau khi tinh sạch và kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp SEB534 trên đối tƣợng thử nghiệm (chuột hoặc thỏ).
2. Nhân dòng biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) ở dạng đột biến không có độc tính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2011), Chiến lược quốc gia an to n thực phẩm giai đoạn 2011- 2020 v tầm nhìn 2030, Bộ Y tế, tr. 4-20.
2. Phạm Văn Ca, Cao Văn Viên (2005), “Tình hình kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus tại Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới năm 2002- 2003”, Tạp chí Y học dự phòng tập XV, 1(73), tr. 51-54.
3. Lê Huy Chính (2009), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội.
4. Nguyễn Văn Dịp (1993), Ứng dụng những nguyên lý về sinh vật học v di truyền học để xác định tính chất dịch tễ học của Staphylococcus aureus, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, tr. 3-5.
5. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn v nhận thức vệ sinh an to n thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm,<http://www.vfa.gov.vn>.
6. Đỗ Thị Hòa (2006), “Phòng chống tụ cầu trùng vàng”, Khoa học phổ thông số 30/06.
7. Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc tại Việt Nam năm 2008 dự báo v giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009 Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, <http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322.9>
8. Bùi Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Thị Vân Lan, Nguyễn Lan Phƣơng (2007), Mức độ ô nhiễm v đặc điểm sinh vật hóa học của các chủng Staphylococcus aureus sinh enterotoxin trong thức ăn đường phố H Nội,Kỷ yếu hội nghị khoa học an toàn vệ sinh thực phẩm Lần thứ 4, Nhà xuất bản Y học, tr. 243-249.
9. Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phƣơng, Bùi Thị Kiều Nƣơng, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga, (2006), Khảo sát tính chất kháng kháng sinh của một số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng và Y học dự phòng, phụ bản của tập 10(số 4), tr. 406-411.
10. Lê Văn Nam, Trần Viết Tiến, Phạm Văn Ca, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Vũ Trung (2014), “Nghiên cứu biểu hiện lâm sàng và tình trạng kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus tại bệnh viện nhiệt đới trung ƣơng và bệnh viện quân y 103”, Tạp chí Y học Việt Nam, tập 433, tr. 42-45.
11. Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phƣơng, Bùi Kiều Nƣơng (2003), Đánh giá mức độc ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố tại th nh phố Hồ Chí Minh năm 2002. Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Thành phố Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm.
12. Lê Duy Thành, Đinh Đoàn Long, Trần Thị Hồng (2009), Cơ sở sinh học phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục, tr 134-150, tr. 195-200.
13. Tạ Thành Văn (2010), PCR v một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, tr. 11-26.
Tiếng Anh
14. Agrawal R., Singh P. K., Sharma S. K., Kamboj D. V., Goel A. K. , Singh L. (2012), “Highly expressed recombinant SEB for antibody production and development of immunodetection system”, Indian J Microbiol 52, pp. 191–196 15. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. (2008), “Genome
sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands”, J Bacteriol 190(1), pp. 300-310.
16. Balaban N.,Rasooly A. (2000), “Staphylococcal enterotoxins”, International Journal of Food Microbiology61(1), pp. 1-10.
17. Bayles K. W., Iandolo J. J. (1989), “Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal enterotoxin D”, J Bacteriol 171(9), pp. 4799-806. 18. Bean N. H., Griffin P. M., Goulding J. S., Ivey C.B. (1990), “Foodborne disease
outbreaks, 5 year summary, 1983-1987”, J Food Prot 53, pp. 711-728.
19. Bergdoll M. S. (1989), Staphylococcus aureus, In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed). Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA: 463-523.
20. Bohach G. A., Schlievert P. M. (1987), “Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins”,
Mol Gen Genet 209(1), pp. 15-20.
21. Bohach G. A., Schlievert P.M. (1989), “Conservation of the biologically active portions of staphylococcal enterotoxins C1 and C2”, Infect Immun 57(7): 2249-2252. 22. Bruce A. G., Kermit D. H. (2009), CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B,
http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview
23. Capucine L., Sylvie P., Francoise D. and Patrick F. (2003), “Detectio and genotyping by real-time PCR of the Staphylococcal enterotoxin genes sea to sej”, Molecuilar and Cellular Probes 17, pp. 139-147.
24. Chang H. C., Bergdoll M. S. (1979), “Purification and some physicochemical properties of staphylococcal enterotoxin D”, Biochemical 18, pp. 1937-1942. 25. Chiang Y. C., Chang, L. T., Lin, C. W., Yang, C. Y. & Tsen, H. Y. (2006). PCR
primers for the detection of staphylococcal enterotoxins K, L, and M and survey of staphylococcal enterotoxin types in Staphylococcus aureus isolates from food poisoning cases in Taiwan. Journal of food protection. 69(5), pp. 1072-9. 26. Chiang Y. C., Liao W. W., Fan C. M., Pai W. Y., Chiou C. S., Tsen H. Y.
(2008), “PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan”, Int J Food Microbiol 121(1), pp. 66-73.
27. Christopher L. J., Saleem A. K. (1986), “Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus”, Journal of bacteriology
166(1): 29-33.
28. Collins C. H., Patricia M. L., Grange J. M. (1995), Staphylococcus and Micococcus, Collines and Lyne’s Microbiological Methods, pp. 353-359.
29. Couch J. L., Soltis M. T. and Betley M. J. (1988), “Cloning and nucleotide sequence of the type E staphylococcal enterotoxin gene”, Journal of bacteriology170, pp. 2954-2960.
30. Cremonesi P. (2005), "Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products”, Mol Cell Probes 19(5), pp. 299-305.
31. Darányi J., Buzna D. (1926), “Aboutthe use of staphylococci in disinfection experiments”, Medical microbiology and immunology 105, pp. 560-563.
32. Ejem A., Damaris A., Timothy R. and Ed G. (2006), “Staphylococcal Enterotoxin B as a Biological Weapon: Recognition, Management, and Surveillance of Staphylococcal Enterotoxin”, Applied Biosafety11(3), pp. 120-126.
33. Genigeorgic C. A. (1989), “Present state of knowledge on staphylococcal intoxication”, Int J Food Microbiol 9, pp. 327-360.
34. Haeghebaert S., Le Q. F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V. (2002), "Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000”, Bull Epidémiol Hebdo 23, pp. 105-109.
35. Henghold W. B. (2004), “Other biologic toxin bioweapons: ricin, staphylococcal enterotoxin B, and trichothecene mycotoxins”, 2nd Dermatol Clin
22(3), pp. 257-262.
36. Herron O. L., Fitzgerald J. R., Musser J. M., Kapur V. (2007), “Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus”, PlosOne 2(10): E1120.
37. Hilmberg S. D., Blake P. A. (1984), "Staphylococcal food poisoning in the United State”, J Am Med Assoc 251, pp. 487-489.
38. Hisaya K. O., Katsuhiko O., Ken'ichi I., Yoshihiro I., Dong-Liang H., Hidehito K., Naoyuki S., Akio N., Takehiko U., Kunihiro S. (2008), “Identification and Characterization of Two Novel Staphylococcal Enterotoxins, Types S and T”,
Infect Immun 76(11), pp. 4999-5005
39. Hovde C. J., Hackett S. P., Bohach G. A. (1990), “Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C3 gene: sequence comparison of all three type C staphylococcal enterotoxins” Mol Gen Genet 220(2).
40. Huang L. Y., Bergdoll M. S. (1970), “The primer structure of staphylococcal enterotoxin B”, J Biol Chem 245, pp. 3518-3525.
41. Jones C. L., Khan S. A. (1986), “Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus”, J Bacteriol 166(1), pp. 29-33.
42. Jordan E. O., Burrows W. (1934), “Further observations on staphylococcus food poisoning”, Am J Hyg 20, pp. 604-610.
43.Kadariya J., Smith T. C., Thapaliya D. (2014), “Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health”,
Biomed Res Int 2014; 2014: 827965.
44. Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K. (2003), “Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions”, Toxicology 187(2/3), pp. 229-238.
45. Kusumaningrum H. D., Van Putten M. M., Rombouts F. M., Beumer R. R. (2002), “Effects of antibacterial dishwashing liquid on foodborne pathogens and competitive microorganisms in kitchen sponges”, J Food Protect 65(1), pp. 61-65. 46. Leggiadro R. J. (2000), “The threat of biological terrorism: a public health and
infection control reality”, Infect Control Hosp Epidemiol 21(1), pp. 53-56. 47. Martin M. C., Fueyo J. M., Gonzalez-Hevia M. A., Mendoza M. C. (2004),
“Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of
Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks”, Int J Food Microbiol
94(3), pp. 279-286.
48. Mary K. S. and John L. M. (2002), “Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches”, Food control 15, pp. 5-10.
49. Mead P. S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L. F., Bresee J. S., Shapiro C., Griffin P. M., Tauxe R. V. (1999), “Food-related illness and death in the United States”, Emerg Infect Dis 5(5), pp. 7-25.
50. Monaco M., Pedroni P., Sanchini A., Bonomini A., Indelicato A., Pantosti A. (2013), “Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus
responsible for human colonization and infection in an area of Italy with high density of pig farming”, BMC Infect Dis 13(1), pp. 258.
51.Mossong J., Decruyenaere F., Moris G., Ragimbeau C., Olinger C. M., Johler S., Perrin M., Hau P., Weicherding P. (2015), “Investigation of a staphylococcal food poisoning outbreak combining case-control, traditional typing and whole genome sequencing methods, Luxembourg, June 2014”, Euro Surveill 2015, 20(45).
52. Munson S. H., Tremaine M. T., Betley M. J., Welch R. A.(1998), “Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus”, Infect Immun 66(7), pp. 3337-3348.
53. Omoe K., Ishikawa M., Shimoda Y., Hu D. L., Ueda S., Shinagawa K. (2002), “Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates Harboring seg, seh, or sei genes”, J Clin Microbiol 40(3), pp. 57-62.
54. Reginald W. B. and Gayle A. L. (2001), Bacteriological Analytical Manual Online (Chapter12: Staphylococcus aureus), Center for Food Safety & Applied Nutrition, U. S. Food and Drug Administration.
55. Salasia S. I., Tato S., Sugiyono N., Ariyanti D., Prabawati F. (2011), “Genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovines, humans, and food in Indonesia”, J Vet Sci 12(4), pp. 353-361.
56. Schmitt M., Schuler S. U., Scmidt L. W. (1990), “Temperature limits off growth, Tnase, and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strain isolated from food”, Int J Food Mcrobiol 11, pp. 1-19.
57. Ulrich R. G., Sidell S., Taylor T. J., Wilhelmsen C. L., Franz D. R. (1997),
Staphylococcal enterotoxin B and related pyrogenic toxins, In the textbook of military medicine, warfare, weaponry, and the casuality. Medical aspects of chemical and biological warfare. Falls Church, VA: Office of the Surgeon General, Department of the Army. Available at: <www.bordeninstitute.army.mil/cwbw/Ch31.pdf>
58. Varshney A. K., Wang X., Cook E., Dutta K., Scharff M. D., Goger M. J., Fries B. C. (2011), “Generation, characterization, and epitope mapping of neutralizing and protective monoclonal antibodies against Staphylococcal enterotoxin B induced lethal shock”, J Biol Chem 286, pp. 9737-9747.
59. Wei H. L., Chiou C. S. (2001), Molecular subtyping of Staphylococcus aureus from an outbreak associated with a food handler, Epidemiol Infect 128, pp.15-20. 60. Wieneke A. A., Roberts D., Gilbert R. J. (1993), “Staphylococcal food poisoning
in the United Kingdom, 1969-90”, Epidemiol Infect 110, pp. 519-531.
61. William G Gilroy (2005), Drug-resistant staph infections becoming an increasingly difficult health challenge, University of Notre Dame. <http://lumen.nd.edu/2005_04/Drug-resistantstaph.shtml>
62. Yang Z., Zhang L., Zhang Y., Zhang T., Feng Y., Lu X., Lan W., Wang J., Wu H., Cao C., Wang X. (2011), “Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method”, Plos One 6(7), e22981.
Internet 63. http://swampie.wordpress.com/2008/02/17/ 64. http://wiki.ggc.edu/wiki/Necrotizing_Fasciitis_Spring_'13 65. http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html 66. http://lumen.nd.edu/2005_04/Drug-resistantstaph.shtml 67. http://www.sciencedaily.com/releases/ 2007/05/070521145512.html 68. http://bioinfo.bact.wisc.edu/ themicrobialworld/stawilliph.html 69. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1213 70. https://www.addgene.org/12651/