3.3.1. Xử lý enzym cắt hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb534 và vector pET22(b+)
Dựa trên kết quả nghiên cứu bản đồ cắt giới hạn của gen seb534, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET22(b+) và vector tách dòng pTZ57R/T, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII không có trong trình tự gen seb534, có trong vùng đa tách dòng vector pET22(b+), pTZ57R/T. Chính vì vậy, khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII vào hai đầu đoạn gen
seb534 (đầu 5’ và đầu 3’). Hai enzym này sẽ tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng.
Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành cắt seb534 bằng hai enzym
EcoRI và HindIII nhƣ mô tả ở mục 2.2.7. Sản phẩm PCR sau khi cắt tạo đầu sole bằng hai enzym đƣợc tinh sạch theo quy trình của bộ kit Thermo Scientific (Mỹ) và đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; 1: Sản phẩm cắt mở vòng seb534
Kết quả điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch chỉ xuất hiện một vạch duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 534 bp. Nhƣ vậy, sản phẩm sau khi tinh sạch có độ tinh sạch cao đủ điều kiện để ghép nối vào vector biểu hiện pET22(b+) ở các thí nghiệm tiếp theo.
Bƣớc tiếp theo, cắt mở vòng plasmid pET22(b+) cũng bằng hai enzym EcoRI và HindIII trong 3 giờ ở 37oC để tạo đầu sole tƣơng tự nhƣ đối với gen seb534 phục vụ cho việc ghép nối đoạn gen seb534 vào vector pET22(b+). Sản phẩm cắt đƣợc tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt mở vòng plasmid pET22(b+) đƣợc thể hiện trong hình 3.8.
Hình 3.8. Điện di đồ plasmid pET22(b+) sau khi cắt bằng các enzym hạn chế
Kết quả điện di đồ cho thấy, vector sau khi mở vòng bằng hai enzym hạn chế trên là một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 5500 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pET22(b+) nhƣ trong lý thuyết.
3.3.2. Gắn đoạn gen đích seb534 vào vector biểu hiện pET22(b+)
Vector pET22(b+) sau khi cắt mở vòng, tạo đầu sole bằng enzym hạn chế và tinh sạch sẽ đƣợc ghép nối với gen đích seb534 tạo thành vector tái tổ hợp
seb534/pET22(b+) nhờ xúc tác của enzym T4 DNA ligase. Thành phần phản ứng ghép nối nhƣ mục 2.2.8.
Sản phẩm ghép nối là vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3). E. coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thƣờng đƣợc sử dụng khi biểu hiện 1 protein lạ, phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 nhƣ vector pET22(b+). Hơn nữa chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) đã đƣợc biến đổi để tăng cƣờng khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tƣợng và mục đích nghiên cứu của đề tài. Thành phần phản ứng, các bƣớc tiến hành biến nạp nhƣ mô tả ở mục 2.2.9.
Sau khi biến nạp thành công vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, dịch khuẩn đƣợc cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/ml. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện trên hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3)
Kết quả của quá trình nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa kháng sinh chọn lọc cho thấy, trên đĩa thạch có nhiều khuẩn lạc phát triển. Tuy nhiên, không biết khuẩn lạc nào mang vector tái tổ hợp.
Bản thân các tế bào E. coli BL21(DE3) không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin, khả năng kháng kháng sinh ampicillin có đƣợc là từ vector pET22(b+) hoặc vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Do đó, sau khi biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối ghép và nuôi cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100 mg/ml sẽ có các trƣờng hợp sau xảy ra:
1. Các tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc đƣợc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh ampicillin.
2. Các tế bào khả biến chỉ chứa vector biểu hiện tự đóng vòng (do một trong 2 enzym cắt không hoàn toàn), có gen kháng kháng sinh nên vẫn tồn tại và tạo khuẩn lạc.
3. Các tế bào khả biến có chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) có gen kháng kháng sinh nên mọc đƣợc trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc.
Để đảm bảo độ chính xác của các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra một số khuẩn lạc trên đĩa thạch theo hai cách là: PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu và tách DNA plasmid cắt kiểm tra bằng hai enzym hạn chế đã đƣợc sử dụng để cắt mở vòng gen và vector.
3.3.3. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+)
3.3.3.1. Chọn lọc bằng phản ứng colony-PCR
Để kiểm tra khuẩn lạc của dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp
seb534/pET22(b+), chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR). Các bƣớc tiến hành, thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ mô tả ở mục 2.2.3. Kết quả sau khi tiến hành colony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+)
M: Thang DNA chuẩn 1 kb;
1-4: Sản phầm colony-PCR từ các dòng khuẩn lạc khác nhau; (-): Đối chứng âm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, ở 4 giếng (giếng 1, 2, 3, 4 - tƣơng ứng với 4 dòng khuẩn lạc) đều xuất hiện một băng DNA có kích thƣớc khoảng 534 bp phù hợp với kích thƣớc gen seb534 theo tính toán lý thuyết. Kết quả trên cho thấy, cả 4 dòng khuẩn lạc trên đều chứa plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Để kết quả chắc chắn hơn, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid và cắt bằng hai enzym hạn chế kiểm tra plasmid của các dòng khuẩn lạc nói trên.
3.3.3.2. Chọn lọc bằng phương pháp enzym hạn chế
Phƣơng pháp này cho kết quả với độ chính xác cao hơn. Chúng tôi tiến hành tách và cắt kiểm tra plasmid của 4 dòng khuẩn lạc trên bằng chính 2 enzym đã sử dụng để cắt mở vòng là EcoRI và HindIII. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.10 và 2.2.7. Sản phẩm xử lí plasmid tái tổ hợp các dòng bằng enzym hạn chế đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid seb534/pET22(b+) của các dòng khuẩn lạc
M: Thang DNA chuẩn 1 kb;
1-4: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc khác nhau.
Kết quả điện di đồ cho thấy: sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp
seb534/pET22(b+) bằng enzym hạn chế sau khi điện di trên cả 4 giếng (giếng 1, 2, 3, 4 - tƣơng ứng với 4 dòng khuẩn lạc) đều xuất hiện 2 băng DNA: băng phía trên có kích thƣớc khoảng 5500 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pET22(b+); băng phía dƣới có kích thƣớc khoảng 534 bp phù hợp với kích thƣớc gen seb534
theo tính toán lý thuyết. Từ kết quả trên chúng tôi nhận định: đoạn gen đích seb534
đã đƣợc gắn thành công vào vector biểu hiện pET22(b+); cả 4 dòng khuẩn lạc trên đều chứa plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Nhƣ vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện seb534/pET22(b+).
3.4. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 trong tế bào E. coli
BL21(DE3)
3.4.1. Biểu hiện gen seb534 trong tế bào E. coli BL21(DE3)
Tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) sau khi biến nạp thành công vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) sẽ đƣợc nuôi trong môi trƣờng có chứa kháng sinh chọn lọc Ampicillin và chất cảm ứng là IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside). Gen đích seb534 trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG có trong môi trƣờng.
Theo tính toán lý thuyết, protein đích SEB534 đƣợc biểu hiện sẽ có khối lƣợng phân tử khoảng 22 kDa.
Quy trình biểu hiện gen seb534 trong tế bào khả biến E. coliBL21(DE3) đƣợc tiến hành theo mô tả ở mục 2.2.12. Để kiểm tra chất lƣợng và tính chất của protein đích (protein ở dạng tan hay không tan) chúng tôi tiến hành nuôi cảm ứng ở 28oC, 30oC; sinh khối tế bào đƣợc siêu âm trong đệm PBS, ly tâm thu pha dịch và pha cặn, sau đó tiến hành điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện protein SEB534
1: Protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc seb534/pET22(b+)/BL21 không được cảm ứng IPTG.
2: Protein tổng số pha tan ở 30oC; 3: Protein tổng số pha không tan ở 30oC; 4: Protein tổng số pha tan ở 28o
C; 5: Protein tổng số pha không tan ở 28oC; M: Thang chuẩn protein
Kết quả trên hình cho thấy: ở giếng 1 không xuất hiện băng protein SEB có kích thƣớc 22 kDa do dòng này không đƣợc cảm ứng IPTG. Các giếng 2, 3, 4 và 5 đều xuất hiện băng protein có kích thƣớc khoảng 22 kDa phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của protein SEB534 do đƣợc cảm ứng IPTG. So sánh kết quả thu đƣợc ở giếng 2 với giếng 3 và giếng 4 với giếng 5, chúng tôi thấy protein SEB534 đƣợc biểu hiện chủ yếu nằm ở pha không tan.
Để cải thiện tính tan và thu đƣợc lƣợng protein SEB534 tốt nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi biểu hiện đến khả năng biểu hiện của gen seb534 trong tế bào khả biến E. coli BL21(DE3).
3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534
Rất nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng, protein vật chủ, thành phần và nồng độ các chất dinh dƣỡng… làm ảnh hƣởng đến sự tổng hợp protein SEB trong tế bào khả biến E. coli BL21(DE3). Cho nên việc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho tổng hợp protein ngoại lai là điều rất quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát yếu tố nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cảm ứng để thu đƣợc lƣợng protein SEB tốt nhất phục vụ cho nghiên cứu.
3.4.2.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn và khá phức tạp đến sự tổng hợp protein tái tổ hợp trong tế bào chủ. Thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, nhiệt độ này không hẳn đã là nhiệt độ thích hợp cho sự tổng hợp protein tái tổ hợp. Bởi vì 37oC là nhiệt độ thích hợp cho các protease nội bào hoạt động, do đó các protein ngoại lai sẽ bị phân cắt sau khi tổng hợp, điều này ảnh hƣởng đến hiệu suất biểu hiện và chất lƣợng protein. Bên cạnh đó, ở nhiệt độ tối ƣu protein tái tổ hợp do đƣợc điều khiển bởi promoter mạnh nhƣ T7 promoter sẽ đƣợc tổng hợp ồ ạt một lƣợng lớn trong một khoảng thời gian ngắn. Trong khi đó, các protein chức năng khác tham gia vào quá trình tạo cấu trúc protein bậc cao hơn lại không đƣợc tổng hợp với tốc độ tƣơng ứng. Điều này ảnh hƣởng đến cấu trúc thứ cấp của protein tái tổ hợp và thông thƣờng làm cho protein đƣợc tổng hợp dƣới dạng không tan, có hoạt tính thấp hoặc thậm chí mất hoạt tính.
Với mục đích thu đƣợc một lƣợng lớn protein SEB với hoạt tính cao, không lẫn quá nhiều protein của E. coli, dễ dàng tinh sạch protein trong các nghiên cứu sau này, do đó chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 20o
C, 28oC và 37o
độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và thời gian cảm ứng 5 giờ. Sau 5 giờ nuôi cảm ứng tế bào đƣợc thu lại để kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.12. Dịch chiết và phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả đƣơc thể hiện trên hình 3.13.
Hình 3.13. Điện di đồ ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534
1: Protein SEB534 không cảm ứng IPTG
2-4: Protein thu được ở nhiệt độ khác nhau tương ứng theo thứ tự l 37oC; 28oCv 20o
C; M: Thang chuẩn protein
Kết quả trên hình cho thấy: ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEB534 đậm, rõ nét hơn hẳn so với hai băng protein SEB534 ở giếng số 3 và giếng số 4. Điều này cho thấy, ở nhiệt độ 37oC protein tái tổ hợp SEB534 đƣợc biểu hiện tốt hơn so với điều kiện nhiệt độ ở 28oC và 20oC. Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn 37oC là nhiệt độ cảm ứng thích hợp nhất để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.2. Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG
Sự biểu hiện gen đích seb534 thành protein tái tổ hợp SEB đƣợc điều khiển bởi T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) có trong môi trƣờng. Do đó, để seb534 biểu hiện thì
E. Coli BL21(DE3) sau biến nạp sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Khi môi trƣờng nuôi cấy có chất cảm ứng IPTG, T7 lac promoter hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 polymerase. T7 polymerase đƣợc tạo thành sẽ bám vào vị trí T7 promoter để khởi đầu quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEB. Nồng độ chất chất cảm ứng IPTG ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện protein SEB. Lƣợng protein SEB tạo ra ít khi nồng độ IPTG quá thấp nhƣng ở nồng độ quá cao nó lại gây độc cho tế bào. Bên cạnh đó, IPTG là một hóa chất đắt tiền nên việc xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG cần bổ sung ở những nồng độ thấp mà hiệu quả biểu hiện protein SEB vẫn cao sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát IPTG ở những nồng độ sau: 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM ở 37oC và thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng để kiểm tra mức độ biểu hiện. Dịch chiết và phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.12. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.14.
Hình 3.14. Điện di đồ ảnh hƣởng của nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543
M: Thang chuẩn protein; 1: Mẫu không cảm ứng IPTG;
2-5: Protein SEB534 thu được sau khi cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau theo thứ tự l : 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM;
Kết quả trên hình cho thấy: Ở cả 4 giếng 2, 3, 4, 5 với nồng độ IPTG khác nhau từ thấp đến cao đều xuất hiện băng protein SEB534. Tuy nhiên, ở giếng thứ 3, với nồng độ IPTG 0,5 mM cho băng protein SEB534 đậm và rõ nét hơn so với các băng ở giếng 2, 4 và 5. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM cho nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.3. Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy
Để thu đƣợc protein tái tổ hợp SEB với lƣợng lớn, chất lƣợng tốt, tiết kiệm chi phí và thời gian thì cần phải tối ƣu hoá thời gian cảm ứng. Trong quá trình cảm ứng, lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tạo thành tỷ lệ thuận với lƣợng sinh khối tế bào cảm ứng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu từ 0 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM và nuôi cấy ở 37oC.