Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và nghiên cứu S. aureus. Kết quả xác định sẽ nhanh hơn, nhiều trƣờng hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao. Ngoài việc xác định nhanh căn nguyên vi khuẩn với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của S. aureus.
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Nguyên lý của phản ứng PCR: Dựa theo sự sao chép theo cơ chế bán bảo tồn của DNA trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới. Kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn theo chiều 5’ đến 3’ dƣới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch DNA mới đƣợc hình thành với các
nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi DNA khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lƣợng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi [13].
- Ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định S. aureus: David P. Kateete và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nhân gen nuc của S. aureus đƣợc sử dụng nhƣ kỹ thuật cơ bản, là tiêu chuẩn vàng để xác định S. aureus. Paola Cremonesi ứng dụng PCR đa mồi để xác định các gen cog, nuc, sea, seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej, sel. Kỹ thuật PCR đa mồi này có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật ELISA [30].
1.4.2.2. Kỹ thuật realtime PCR
Nguyên lý: Là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát hiện vừa định lƣợng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime nghĩa là đúng thời điểm). Đây là kỹ thuật phát hiện không đồng nhất, một hỗn hợp của sản phẩm PCR đƣợc phát hiện mà không phải từng thành phần đƣợc phát hiện nhƣ trong kỹ thuật điện di thông thƣờng [23].
Ưu điểm:
- Kiểm soát đƣợc lƣợng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định đƣợc lƣợng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ thuật PCR thông thƣờng, gel agarose có nhiều hạn chế nhƣ độ phân giải thấp do vậy định lƣợng thƣờng không chính xác.
- Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại.
- Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1 - 2 h trong khi PCR truyền thống phải mất từ 3 - 5h.
- Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm.
1.4.2.3. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism)
- Nguyên lý: Sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt sản phẩm PCR tạo nên những đoạn cắt khác nhau và xác định kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid.
- Ứng dụng kỹ thuật RFLP để xác định tính đa hình của gen đƣợc cắt. Ví dụ cắt bằng AluI xác định gen mã hóa coagulase của S. aureus. Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase [55].
1.4.2.4. Giải trình tự gen
Hai phƣơng pháp chính xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Phƣơng pháp của Sanger đƣợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu y sinh học [12]. Phƣơng pháp này dựa vào sự tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ xung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trƣng của phƣơng pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thƣờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3’OH đƣợc thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester, do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả phản ứng tạo ra các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm đƣợc đem phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả đƣợc đọc trên máy tự ghi [13].