Rất nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng, protein vật chủ, thành phần và nồng độ các chất dinh dƣỡng… làm ảnh hƣởng đến sự tổng hợp protein SEB trong tế bào khả biến E. coli BL21(DE3). Cho nên việc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho tổng hợp protein ngoại lai là điều rất quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát yếu tố nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cảm ứng để thu đƣợc lƣợng protein SEB tốt nhất phục vụ cho nghiên cứu.
3.4.2.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn và khá phức tạp đến sự tổng hợp protein tái tổ hợp trong tế bào chủ. Thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, nhiệt độ này không hẳn đã là nhiệt độ thích hợp cho sự tổng hợp protein tái tổ hợp. Bởi vì 37oC là nhiệt độ thích hợp cho các protease nội bào hoạt động, do đó các protein ngoại lai sẽ bị phân cắt sau khi tổng hợp, điều này ảnh hƣởng đến hiệu suất biểu hiện và chất lƣợng protein. Bên cạnh đó, ở nhiệt độ tối ƣu protein tái tổ hợp do đƣợc điều khiển bởi promoter mạnh nhƣ T7 promoter sẽ đƣợc tổng hợp ồ ạt một lƣợng lớn trong một khoảng thời gian ngắn. Trong khi đó, các protein chức năng khác tham gia vào quá trình tạo cấu trúc protein bậc cao hơn lại không đƣợc tổng hợp với tốc độ tƣơng ứng. Điều này ảnh hƣởng đến cấu trúc thứ cấp của protein tái tổ hợp và thông thƣờng làm cho protein đƣợc tổng hợp dƣới dạng không tan, có hoạt tính thấp hoặc thậm chí mất hoạt tính.
Với mục đích thu đƣợc một lƣợng lớn protein SEB với hoạt tính cao, không lẫn quá nhiều protein của E. coli, dễ dàng tinh sạch protein trong các nghiên cứu sau này, do đó chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 20o
C, 28oC và 37o
độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và thời gian cảm ứng 5 giờ. Sau 5 giờ nuôi cảm ứng tế bào đƣợc thu lại để kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.12. Dịch chiết và phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả đƣơc thể hiện trên hình 3.13.
Hình 3.13. Điện di đồ ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534
1: Protein SEB534 không cảm ứng IPTG
2-4: Protein thu được ở nhiệt độ khác nhau tương ứng theo thứ tự l 37oC; 28oCv 20o
C; M: Thang chuẩn protein
Kết quả trên hình cho thấy: ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEB534 đậm, rõ nét hơn hẳn so với hai băng protein SEB534 ở giếng số 3 và giếng số 4. Điều này cho thấy, ở nhiệt độ 37oC protein tái tổ hợp SEB534 đƣợc biểu hiện tốt hơn so với điều kiện nhiệt độ ở 28oC và 20oC. Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn 37oC là nhiệt độ cảm ứng thích hợp nhất để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.2. Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG
Sự biểu hiện gen đích seb534 thành protein tái tổ hợp SEB đƣợc điều khiển bởi T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) có trong môi trƣờng. Do đó, để seb534 biểu hiện thì
E. Coli BL21(DE3) sau biến nạp sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Khi môi trƣờng nuôi cấy có chất cảm ứng IPTG, T7 lac promoter hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 polymerase. T7 polymerase đƣợc tạo thành sẽ bám vào vị trí T7 promoter để khởi đầu quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEB. Nồng độ chất chất cảm ứng IPTG ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện protein SEB. Lƣợng protein SEB tạo ra ít khi nồng độ IPTG quá thấp nhƣng ở nồng độ quá cao nó lại gây độc cho tế bào. Bên cạnh đó, IPTG là một hóa chất đắt tiền nên việc xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG cần bổ sung ở những nồng độ thấp mà hiệu quả biểu hiện protein SEB vẫn cao sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát IPTG ở những nồng độ sau: 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM ở 37oC và thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng để kiểm tra mức độ biểu hiện. Dịch chiết và phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.12. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.14.
Hình 3.14. Điện di đồ ảnh hƣởng của nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543
M: Thang chuẩn protein; 1: Mẫu không cảm ứng IPTG;
2-5: Protein SEB534 thu được sau khi cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau theo thứ tự l : 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM;
Kết quả trên hình cho thấy: Ở cả 4 giếng 2, 3, 4, 5 với nồng độ IPTG khác nhau từ thấp đến cao đều xuất hiện băng protein SEB534. Tuy nhiên, ở giếng thứ 3, với nồng độ IPTG 0,5 mM cho băng protein SEB534 đậm và rõ nét hơn so với các băng ở giếng 2, 4 và 5. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM cho nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.3. Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy
Để thu đƣợc protein tái tổ hợp SEB với lƣợng lớn, chất lƣợng tốt, tiết kiệm chi phí và thời gian thì cần phải tối ƣu hoá thời gian cảm ứng. Trong quá trình cảm ứng, lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tạo thành tỷ lệ thuận với lƣợng sinh khối tế bào cảm ứng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu từ 0 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM và nuôi cấy ở 37oC. Protein thu đƣợc ở các giai đoạn đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.12. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trên hình 3.15.
Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534
1-5: Protein SEB thu được tại các thời điểm từ 1 đến 5 giờ; M: Thang chuẩn protein
Hàm lƣợng protein SEB534 tăng dần sau 5 giờ nuôi biểu hiện trong khi đó hàm lƣợng protein tổng số thì có chiều hƣớng giảm dần. Do vậy, chúng tôi lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng là 5 giờ cho các quá trình tổng hợp protein SEB534.
Từ các thí nghiệm trên cho thấy: điều kiện tối ƣu để cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp SEB534 trong chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) là ở nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM, thời gian cảm ứng 5 giờ.
Protein SEB534 sau khi biểu hiện và tối ƣu các điều kiện khác nhau đƣợc kiểm tra tính tan bằng cách dùng lysozyme và siêu âm để phá tế bào, dịch phá đƣợc
kiểm tra trên gel polyacrylamide. Kết quả cho thấy, việc thay đổi các điều kiện biểu hiện ở trên vẫn không cải thiện đƣợc tính tan của SEB534. Kết quả này tƣơng tự với các nghiên cứu trƣớc khi protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện với lƣợng lớn trong E. coli, khoảng 70% protein tái tổ hợp biểu hiện ở dạng không tan [62]. Công bố của Agrawal và cộng sự đã chỉ ra rằng, ngay cả với biểu hiện protein SEB nguyên v n trong E. coli sử dụng hệ vector pQE30UA, protein SEB thu đƣợc cũng ở dạng không tan và khi tinh sạch cần phải có urea [14]. Một công trình nghiên cứu khác về việc tạo đột biến điểm, tạo đột biến mất đoạn và biểu hiện từng vùng của gen seb, các đoạn gen này đƣợc đƣa vào hệ vector mang protein dung hợp maltose-binding protein (MBP) nhằm cải thiện tính tan của các protein tái tổ hợp. Các đoạn gen khác của SEB đƣợc đƣa vào vector H-MBP-T và biểu hiện trong E. coli cho thấy: đối với protein SEB nguyên v n, SEB đột biến cắt 11 amino acid đầu C, protein biểu hiện ở dạng tan còn các dạng đột biến mất đoạn, biểu hiện đoạn gen ngắn khác, protein tái tổ hợp vẫn tồn tại ở dạng không tan [58]. Nhƣ vậy, việc biểu hiện protein dạng tan phụ thuộc nhiều yếu tố nhƣ: bản chất protein, hệ biểu hiện, điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng. Để cải thiện tính tan của protein tái tổ hợp, nhiều hãng sản xuất vector đã thiết kế thêm protein dung hợp với protein ngoại lai khi biểu hiện.