1.4.3.1. Kỹ thuật ELISA
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) là kỹ thuật thực hiện trên đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng để phát hiện và định lƣợng peptide, protein, kháng thể và các phân tử sinh học. ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Nhược điểm: Phải thao tác trong phòng thí nghiệm; đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có trình độ chuyên môn, thao tác thí nghiệm chính xác; chi phí hoá chất xét nghiệm đắt tiền; mất nhiều thời gian.
Ứng dụng kỹ thật này để xác định độc tố ruột của S. aureus nhƣ SEA, SEB, SEC, SED… Đây là kỹ thuật đƣợc sử dụng từ vài thập kỷ trƣớc nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng, đặc biệt để xác định căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [8].
1.4.3.2. Kỹ thuật xác định bằng phage
Sử dụng các nhóm phage để xác định lysotyp S. aureus ở ngƣời: + Nhóm I: 29, 52, 52A, 79, 80.
+ Nhóm II: 3A, 3C, 55, 71.
+ Nhóm III: 6, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85. + Không xếp hạng: 81, 95, 96 [4].
1.4.3.3. Western Blot
Western Blot là kỹ thuật sử dụng để phát hiện các kháng nguyên protein đặc hiệu của vi khuẩn. Hỗn hợp protein đƣợc chạy điện di trên gel polyacrylamid để phân tách theo trọng lƣợng. Các protein sau khi phân tách bằng phƣơng pháp điện di đƣợc điện chuyển lên màng lai nitrocellulose hay màng PVDF và đƣợc cố định trên màng. Sau khi các protein chuyển sang màng lai, màng đƣợc phủ bằng dung dịch blocking để khoá các gốc tự do. Sử dụng kháng thể thứ nhất để liên kết đặc hiệu với kháng nguyên trên màng lai, sau đó sử dụng kháng thể thứ 2 cộng hợp enzym cho lên màng lai để liên kết với kháng thể 1. Sau đó bổ sung cơ chất tƣơng ứng với enzym, phản ứng màu xuất hiện và xác định đƣợc protein cần phát hiện.
Ưu điểm: Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Nhược điểm: Đòi hỏi phải tiến hành trong phòng thí nghiệm; đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có chuyên môn, kỹ thuật cao; giá thành chi phí về nguyên vật liệu và hoá chất đắt tiền; mất nhiều thời gian.
1.4.3.4. Phương pháp phát hiện nhanh dạng que nhúng
Đây là dụng cụ chỉ chuyên sử dụng cho việc xét nghiệm chẩn đoán. Phƣơng pháp này dựa theo nguyên lý sắc ký miễn dịch định tính chẩn đoán sơ bộ phát hiện sự có mặt của kháng nguyên, cơ sở là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu của nó.
Phản ứng đƣợc thực hiện trên màng mỏng, gồm: kháng thể phát hiện thƣờng là một kháng thể đơn dòng di động trên màng; kháng thể thứ 2 có thể là kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng cố định trên màng; kháng nguyên cần phát hiện là yếu tố đặc hiệu của vi khuẩn.
Phản ứng kết hợp giữa phức hợp kháng nguyên - kháng thể di động và kháng thể cố định trên màng để tạo thành vạch T (Test line) và vạch C (control line) tức là mẫu cần kiểm tra có yếu tố kháng nguyên. Mẫu cần kiểm tra không có yếu tố kháng nguyên thì trên que thử chỉ xuất hiện một vạch tại vùng C (control line).
Phƣơng pháp phát hiện nhanh dạng que nhúng có nhiều ƣu điểm: Đây là phƣơng pháp phát hiện nhanh (cho kết quả trong vài phút thực hiện) và khá chính xác (độ nhạy và đặc hiệu cao) các tác nhân sinh học cụ thể là vi khuẩn, virus...; cách sử dụng rất dễ dàng với thao tác đơn giản; que thử gọn nh , tiện lợi, dễ bảo quản, giá thành rẻ.
Chƣơng II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
2.1.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên đƣợc Phòng Công nghệ sinh học Môi trƣờng - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Chủng tách dòng Escherichia coli DH5α (Invitrogen, Mỹ). - Chủng biểu hiện Escherichia coli BL21(DE3) (Invitrogen, Mỹ).
2.1.1.2. Plasmid
- Plasmid pTZ57R/T, kích thƣớc 2886 bp (Thermo Science, Mỹ). - Plasmid pET22b(+), kích thƣớc 5493 bp (Novagen, Mỹ).
2.1.1.3. Các mồi sử dụng
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng cho tách dòng
2.1.2. Các bộ kit
- Kit tinh sạch DNA (Thermo Scientific - Mỹ). - Kit tách chiết plasmid (Thermo Scientific - Mỹ).
- Kit tinh sạch protein sắc kí ái lực cột resin (Protein Purification Protocols của hãng Invitrogen).
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất
Các hóa chất chính sử dụng đƣợc liệt kê ở bảng 2.2.
SEB Exp-F 5’ccg GAATTCatg CCA GAT GAG TTG CAC AAA 3’ SEB Exp-R 5’ cccAAGCTTtca TCC CGT TTC ATA AGG CGA 3’
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng chính
Tên hóa chất Hãng sản xuất
Tris base Applied BioSciences (Mỹ)
Lysozyme Fermentas (Mỹ)
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Fermentas (Mỹ)
Protein K Sigma (Mỹ)
Peptone Fermentas (Mỹ)
NaCl, NaOH, NiCl2, MgSO4, MgCl2, CaCl2 Merck (Đức)
IPTG Sigma (Mỹ)
Acrylamide 30% Sigma (Mỹ)
APS (Ammonium persulfate) Sigma (Mỹ)
TEMED Fermentas (Mỹ)
Taq-DNA-polymerase Fermentas (Mỹ)
Ampicilin Fermentas (Mỹ)
Thang chuẩn DNA, protein Fermentas (Mỹ)
EcoRI NEB (Mỹ)
HindIII NEB (Mỹ)
Ethanol tuyệt đối Fermentas (Mỹ)
Ethanol 70% Fermentas (Mỹ)
Agar Fermentas (Mỹ)
2.1.3.2. Môi trường nuôi cấy
- Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) dịch: 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men, 1% (w/v) NaCl, pH 7,5.
- Môi trƣờng LB thạch thành phần nhƣ LB dịch và đƣợc bổ sung 2% (w/v) agar. - Môi trƣờng chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid bổ sung 100 mg/ml ampicillin.
2.1.3.3. Thiết bị v máy móc
Bảng 2.3. Các máy móc và thiết bị sử dụng
Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất
Tủ lạnh -4oC, -80oC Nuaire (Mỹ)
Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Nuaire (Mỹ)
Bộ điện di protein C.B.S Sientific (Mỹ)
Cân điện tử (Electronic balances) Ohaus (Mỹ)
Lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản)
Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) ThommasScientific (Mỹ)
Máy lắc ổn nhiệt N-Biotek (Hàn Quốc)
Máy đo OD ThommasScientific (Mỹ)
Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417R ThommasScientific (Mỹ)
Máy siêu âm Eppendorf (Đức)
Máy Votex Micro one ThommasScientific (Mỹ)
Máy hút chân không Seep-Vac 110A Tomy KogyO (Nhật Bản)
Máy PCR (Themo cycle) PCR Themocycle
Máy chụp ảnh Gel – Doc Bio-rad (Pháp)
Tủ hút vô trùng Savant (Mỹ)
Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-Avant Applied BioSciences (Mỹ)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách DNA tổng số
Nguyên lý:
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, nhƣ lipid, glucid, protein... đƣợc thực hiện qua nhiều bƣớc, cơ bản qua 3 giai đoạn sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại bỏ protein, (3) tủa DNA.
2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên lý:
PCR (polymerase chain reaction) - phản ứng chuỗi trùng hợp do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985. Đây là phƣơng pháp nhân bản nhanh invitro một trình tự DNA bằng enzym polymerase với một cặp mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngƣợc) qua phản ứng chuỗi trong một chu kì nhiệt. Phƣơng pháp này tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong tế bào vi sinh vật, nhƣng cũng có những đặc điểm khác biệt nhƣ: dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi DNA sợi kép, mồi đƣợc thiết kế chủ động, kết hợp với Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp.
Tiến h nh:
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 2.4 và hình 2.1 Bảng 2.4. Thành phần PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
Dream buffer 10 X 2
dNTP 0,25 mM 2
Mồi xuôi 10 pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10 pmol/µl 1
Taq polymerase 5 u/µl 0,2
DNA khuôn 50-100 ng/µl 1
dH20 (Nƣớc khử ion vô trùng) 12,8
Hình 2.1. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
2.2.3. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony - PCR)
Nguyên lý:
Kỹ thuật colony - PCR dựa trên các nguyên lý kỹ thuật PCR, chỉ khác ở chỗ DNA đƣợc thay bằng DNA plasmid giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94 - 96°C) màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ giải phóng plasmid tái tổ hợp, plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Tiến h nh:
Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25 µl nƣớc khử ion. Sau đó sử dụng 5 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện nhƣ mô tả tại mục (Phƣơng pháp PCR).
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý:
Điện di trên gel agarose là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tách các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau dƣới tác dụng của điện trƣờng. Các phân tử DNA tích điện âm nên khi bị đặt trong 1 điện trƣờng đồng đều thì chúng sẽ dịch chuyển từ cực âm về cực dƣơng của điện trƣờng. Gel agarose có cấu tạo có các lỗ do các dây polyme agarose đan với nhau tạo thành mạng lƣới nên sẽ cản trở đƣờng đi của các phân tử DNA. Phân tử DNA có kích thƣớc càng lớn thì di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. 94oC 94oC 62oC 72oC 72oC 4oC 32 chu kì 3phút 30 giây 1 phút 10 phút 50 giây ∞
2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm từ gel agarose
Nguyên lí :
Đây là phƣơng pháp sử dụng để tinh sạch đoạn DNA quan tâm từ bản điện di trên gel agarose. Sau khi đƣợc nhân bản bằng phƣơng pháp PCR, đoạn gen seb sẽ đƣợc tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phƣơng pháp này phân tử DNA quan tâm sẽ đƣợc giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử DNA này.
2.2.6. Phương pháp tách dòng gen seb trong vector pTZ57R/T
Nguyên lý:
Mục đích của việc tách dòng là tạo vector tái tổ hợp rồi chuyển vector tái tổ hợp này vào các tế bào chủ nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Trong luận văn này DNA ngoại lai là seb534 đƣợc nối vào vector pTZ57R/T nhằm tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Sau đó, vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α.
Việc ghép nối phải dựa trên cơ sở cấu trúc của plasmid pTZ57R/T đƣợc thể hiện trên hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T
Tiến h nh:
1. Thiết lập phản ứng nối gồm các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (l) Đệm nối (5X) 6 Sản phẩm PCR 4 Vector pTZ57R/T 3 Nƣớc khử ion 16 Enzym T4 DNA 1 Tổng thể tích 30
2. Đảo trộn nh và ly tâm trong 3 đến 5 giây. 3. Ủ hỗn hợp phản ứng 22o
C trong 1 giờ.
4. Sau khi phản ứng kết thúc lấy 5 l ở mỗi phản ứng tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42oC trong 40 giây, đặt ngay vào đá trong 20 phút rồi bổ sung môi trƣờng LB dịch để nuôi ở 37 oC trong 1 giờ.
5. Sản phẩm sau biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng thạch đĩa LB có bổ sung Ampicillin (tỉ lệ LB dịch : Amp = 1000 : 1).
6. Nuôi tĩnh ở 37oC qua đêm.
2.2.7. Phương pháp xử lý enzym hạn chế trên gen seb và vector biểu hiện pET22b(+)
Nguyên lý:
Enzym hạn chế - Restriction enzym là các endonuclease nội bào có khả năng nhận biết và cắt các đoạn DNA tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Các enzym này phá vỡ các liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases.
Trong nghiên cứu này sử dụng hai enzym hạn chế là: EcoRI và HindIII, với mục đích:
1. Tạo đầu cắt sole cho gen seb534 sau khi đã đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pTZ57R/T;
2. Mở vòng vector biểu hiện pET22b(+) sử dụng cho phản ứng nối với gen
seb534;
3. Kiểm tra vector tái tổ hợp pET22b(+) mang gen seb534 tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi chuyển vector tái tổ hợp vào chủng biểu hiện.
Để gen đích seb534 biểu hiện thành sản phẩm protein thì phải đƣa gen đích vào vector biểu hiện mang các cấu trúc cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã. Các trình tự quan trọng nhất trợ giúp cho quá trình biểu hiện gen đích là: (1) promoter, (2) terminator, (3) trình tự điều hòa (regulator). Trong nghiên cứu này, dựa trên kích thƣớc của đoạn gen đích, yêu cầu của vector biểu hiện chúng tôi đã sử dụng vector pET22(b+) làm vector biểu hiện.
Vector biểu hiện pET22b(+) (hình 2.3) là vector đƣợc thiết kế cho biểu hiện các gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli với nhiều ƣu điểm. Vector pET22(b+) là vector biểu hiện mạnh có kích thƣớc khoảng 5500 bp, mang trình tự peIB ở đầu N’ tại vị trí 224 đến 289 và trình tự His-tag ở đầu C’ tại vị trí 140 đến 157. Vector pET22(b+) chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu quá trình phiên mã và kết thúc quá trình dịch mã. Trình tự peIB và His-tag có chức năng cung cấp điểm đầu dịch mã và kết thúc quá trình dịch mã cũng nhƣ tinh sạch protein bằng liên kết ái lực. Vector biểu hiện có gen kháng ampicillin thuận lợi cho quá trình chọn lọc dòng vi khuẩn sau này. Vector biểu hiện có trình tự rbs (ribosome binding site - vị trí liên kết ribosome) đƣợc thiết kế ở giữa vị trí của promoter và đoạn gen đƣợc chèn vào.
Hình 2.3. Cấu trúc vertor biểu hiện pET22(b+)
(Nguồn:https://www.addgene.org/12651/)
Về cơ bản, thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau là thể tích của các thành phần sẽ đƣợc điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và DNA mẫu.
Tiến h nh:
Phản ứng cắt mở vòng vector pET22b(+) đƣợc thực hiện với các thành phần nhƣ sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng NEBuffer 4
Enzym EcoRI(20 U/µl) Enzym HindIII(20 U/µl) Plasmid pET22b(+) 4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb534 sau khi đã đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pTZ57R/T đƣợc thực hiện với các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng Đệm 4 (10 X)
Enzym EcoRI (20 U/µl) Enzym HindIII (20 U/µl) Sản phẩm PCR 4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET22b(+) mang gen seb534 tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21 thực hiện với các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng Đệm 4 (10 X)
Enzym EcoRI (20 U/µl) Enzym HindIII (20 U/µl) Vector seb534/pET22b(+)
4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn với tỉ lệ sử dụng theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất. Hỗn hợp đƣợc ủ trong 2 giờ ở 37°C, sau đó bất hoạt enzym ở 85oC trong 20 phút, lấy ra đặt ngay vào đá trong 2 phút. Sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.8. Phương pháp ghép nối gen ngoại lai vào vector pET22b(+)
Nguyên lý:
Enzym T4 ligase đƣợc tách chiết từ các tế bảo E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4. Enzym này có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm OH ở đầu 3’ và nhóm phosphat đầu 5’ trên mạch DNA hoặc RNA. Vector biểu hiện tái tổ hợp đƣợc thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET22b(+) sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.
Tiến h nh: Thành phần phản ứng nối ghép gen nhƣ sau:
Thành phần Thể tích Buffer 5x 4 µl DNA plasmid 3 µl Đoạn chèn DNA 9 µl T4 ligase 2,5 µl Nƣớc khử ion 1,5 µl Tổng thể tích 20 µl
Trộn hỗn hợp phản ứng cẩn thận và ủ trong 2 giờ ở 22°C. Sau khi kết thúc, hỗn hợp đƣợc dùng để biến nạp hoặc lƣu giữ ở tủ -20oC.
2.2.9. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Nguyên lý:
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và BL21 theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phƣơng pháp là E. coli đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, sử dụng sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ để tác động lên cấu trúc thành tế bào, tạo điều kiện cho DNA ngoại lai đi vào trong tế bào.
2.2.10. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli DH5α