Trong các loại độc tố ruột của S. aureus, SEB là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp. SEB đƣợc hình thành khi tụ cầu khuẩn S. aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt nhƣ nhiệt độ môi trƣờng gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu… bền với nhiệt và có khả năng hòa tan trong nƣớc do đó khi bị nhiễm vào thức ăn và nƣớc uống chúng không thể bị loại bỏ khi đun nấu [7]. Bên cạnh đó, SEB có khả năng kháng kháng sinh, ví dụ tính kháng nhóm ß- lactam nhƣ methicillin [50]. Nguy hiểm hơn, SEB còn là một trong những nhóm độc tố đƣợc sử dụng làm vũ khí sinh học dùng để tấn công trong khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [35], [46].
Trong những năm 1943 - 1969, SEB của tụ cầu vàng và các vi khuẩn gây bệnh than, bệnh đậu mùa, bệnh sốt xuất huyết… đƣợc Mỹ đƣa vào danh sách vũ khí sinh học sử dụng trong chiến tranh Thế giới thứ II. Một loại vũ khí sinh học có thể vô hiệu ngƣời lính trong chiến trƣờng một cách hiệu quả, trong một khoảng thời gian ngắn. Đây là một tác nhân nguy hại bởi với một lƣợng nhỏ đã đáp ứng đƣợc mục đích làm mất sức chiến đấu so với các hóa chất tổng hợp trong phòng thí nghiệm
[32]. SEB dễ dàng phát tán trong không khí, trong nƣớc uống, trong thức ăn. Từ 3 - 12 giờ sau khi hít phải SEB với liều lƣợng thấp, các triệu chứng giống cúm sẽ xảy ra nhƣ sốt cao (khoảng 40oC đến 41oC), ớn lạnh, khó thở, ho khan, đau cơ, nhức đầu, nôn và buồn nôn có thể kèm theo tiêu chảy. Nồng độ hít phải càng cao ảnh hƣởng càng nghiêm trọng nhƣ: đau thắt ngực, suy nhƣợc, phù phổi hoặc có thể gây tử vong. Sau 2 - 6 giờ, nếu ăn phải độc tố ruột SEB, bệnh nhân sẽ tăng tiết nƣớc bọt, buồn nôn, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy [57]. Từ thực tế cho thấy, việc phát triển các kỹ thuật phát hiện nhanh SEB đóng một vai trò vô cùng quan trọng để bảo vệ sức khoẻ ngƣời lính và nâng cao sức chiến đấu của toàn quân.
1.3.1. Cấu trúc phân tử và cơ chế gây độc của SEB
Trình tự acid amin của SEB đã đƣợc xác định từ năm 1970 [40]. Một phân tử protein SEB hoàn chỉnh bao gồm trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 acid amin ở đầu N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt động trong môi trƣờng ngoài tế bào gồm 239 amino acid trong 1 chuỗi polypeptit đơn, có khối lƣợng phân tử khoảng 28,336 KDa [41]. Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối acid amin cystein ở vị trí 120 và 140 (hình 1.4).
Hình 1.4. Cấu trúc tinh thể của protein SEB
Hình 1.5. Cơ chế gây độc của siêu kháng nguyên
(Nguồn: http://bioinfo.bact.wisc.edu/ themicrobialworld/staph.html)
Độc tố ruột SEB là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích sao đó kích thích gia tăng số lƣợng lớn các lympho T. SEB đƣợc xem là một siêu kháng nguyên của vi khuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vbeta của các thụ thể tế bào T nhƣ: CD4, CD7. Từ đó kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vbeta mà không cần thiết phải có một quá trình thực bào và trình diện thông thƣờng (hình 1.5).
Điều này gây ra sự sản sinh một số lƣợng lớn của cytokine và interleukin (IL- 2), các yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) và các interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng nhƣ: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy… Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột đƣợc sinh ra ồ ạt [22].
Độc tố ruột SEB dễ hòa tan trong nƣớc, tính chất hóa học tƣơng đối ổn định, chịu đƣợc các tác động cơ học vừa phải, chịu đƣợc nhiệt độ sôi. Có thể lƣu trữ hơn một năm nếu đƣợc bảo quản trong môi trƣờng đông lạnh khô.
1.3.2. Gen seb
Năm 1986, Christopher và các cộng sự đã xác định đƣợc trình tự gen mã hóa protein SEB của chủng S. aureus S6 (CAST, 1994). Theo đó, trình tự của một gen
seb hoàn thiện đƣợc tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042 [27]. Đoạn gen seb đƣợc phân lập từ các chủng S. aureus ở nhiều vùng địa lý khác nhau và đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Tác giả Korolev, Savransky và nhiều tác giả trên thế giới đã công bố những nghiên cứu của mình về đoạn gen seb (khoảng 720 bp). Tính độc của SEB đƣợc quy định bởi 4 bộ ba mã hóa cho acid amin Histidine nằm ở các vị trí 12, 32, 105 và 121 [44]. Sau khi phân tích trình tự của đoạn gen seb, chúng tôi nhận thấy đoạn gen seb
có kích thƣớc 534 bp và 720 bp đều chứa 4 vị trí Histidine quan tâm và giữ nguyên vị trí epitop (tức là đảm bảo phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể, cấu hình không gian). Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn nhân đoạn gen seb có chiều dài 534 bp và tiến hành biểu hiện, tinh sạch để phục vụ cho gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể để làm cơ sở so sánh và lựa chọn ra kháng thể nào phù hợp cho việc gắn lên que thử phát hiện nhanh độc tố SEB.
1.3.3. Triển vọng ứng dụng của SEB
Staphylococcal enterotoxin B là siêu kháng nguyên mạnh, có khả năng đề kháng với các chất kháng sinh, tẩy rửa, bền với nhiệt nên khó bị phân huỷ khi đun, nấu ở nhiệt độ cao. Có khả năng lây nhiễm vào thực phẩm, hòa tan trong nƣớc và phát tán trong không khí. Khi lây nhiễm vào cơ thể ngƣời theo con đƣờng tiêu hoá, nó tác động tới đƣờng tiêu hoá gây ngộ độc thực phẩm, biểu hiện thành những triệu chứng cấp tính nhƣ đau bụng, buồn nôn, nôn, nóng sốt, tiêu chảy… Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khoẻ, cuộc sống và tính mạng con ngƣời, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh nặng chi phí cho chăm sóc sức khoẻ, an sinh xã hội quốc gia. Tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus diễn ra ngày càng phức tạp và có chiều hƣớng tăng lên. Do đó, biểu hiện và tinh sạch Staphylococcal enterotoxin B nhằm phục vụ cho nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh sự có mặt của độc tố ruột SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm có ý nghĩa to lớn và cấp thiết.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã có nhiều thành công trong việc tạo ra các phân tử protein SEB dạng đột biến không độc. Năm 2003, Korolev
và cộng sự đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các amino acid histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine lần lƣợt là: 12, 32, 105 và 121 [44]. Phân tử protein là sản phẩm của gen seb720 mang bốn đột biến đã đƣợc biểu hiện và tinh sạch, sau đó đƣợc đánh giá tính kháng nguyên. Kết quả thu đƣợc đã khẳng định sản phẩm protein của gen seb đột biến đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn độc tố của SEB nguyên thủy và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu. Do đó, việc biểu hiện gen seb534 và tinh sạch protein SEB534 dạng tự nhiên sẽ là cơ sở để tạo SEB534 đột biến không độc là nguyên liệu an toàn cho việc sản xuất vaccine và tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột SEB của vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm.
1.4. Các kỹ thuật xác định S. aureus trong phòng thí nghiệm
1.4.1 Các kỹ thuật thông thường xác định S. aureus
Ngày nay đã có nhiều kỹ thuật xác định tụ cầu nhƣ: nhuộm soi, ngƣng kết hạt, Staphylatex, nuclease chịu nhiệt, lysostaphin, định typ phage, ELISA, điện di miễn dịch và thử nghiệm miễn dịch dùng chất phóng xạ… Sau đây là một số kỹ thuật chính đƣợc áp dụng trong phòng xét nghiệm để xác định và nghiên cứu S. aureus. 1.4.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi
Nhuộm Gram để sơ bộ nhận định hình thể của vi khuẩn: tiêu bản đƣợc làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm: cầu khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính trung bình 0,8 µm, đứng lẫn với tế bào mủ, hoặc tập hợp lại thành hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đứng riêng rẽ.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ khuẩn lạc: S. aureus có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dƣơng xếp thành từng đám [3].
1.4.1.2. Nuôi cấy phân lập v xác định
Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp. Thông thƣờng sử dụng thạch máu 5% ủ ở nhiệt độ 35oC - 37oC từ 18 - 24h. Tụ cầu khuẩn mọc tốt trên
hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dùng, nhiệt độ thích hợp 37oC, pH: 7,0 - 7,5 trong khí trƣờng có oxy hoặc kỵ khí tùy tiện.
Trên canh thang: sau 6 giờ tụ cầu đã làm đục đều môi trƣờng, sau 24 giờ có thể có lắng cặn và có váng. Trên thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, bóng, đục, bờ rõ rệt. Sau 24 - 36 giờ xuất hiện sắc tố màu vàng. Trên thạch máu: khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng, có thể có vòng tan huyết hoặc không. Nếu có vòng tan huyết là vòng tan huyết hoàn toàn, tạo thành một vòng trong xung quanh khuẩn lạc (tan máu β). Trên môi trƣờng Chapman (có đƣờng mannit): S. aureus có khả năng sử dụng mannit làm cho môi trƣờng bị acid hóa, do đó màu môi trƣờng chuyển sang vàng [4].
Xác định sự có mặt của enzym coagulase: (enzym làm đông huyết tƣơng) tự do và liên kết.
Kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định S. aureus. Tuy nhiên kỹ thuật này cho kết quả khá lâu (từ 3 - 4 ngày), cần một lƣợng vi khuẩn lớn và không xác định đƣợc các yếu tố ở mức phân tử.
1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và nghiên cứu S. aureus. Kết quả xác định sẽ nhanh hơn, nhiều trƣờng hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao. Ngoài việc xác định nhanh căn nguyên vi khuẩn với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của S. aureus.
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Nguyên lý của phản ứng PCR: Dựa theo sự sao chép theo cơ chế bán bảo tồn của DNA trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới. Kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn theo chiều 5’ đến 3’ dƣới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch DNA mới đƣợc hình thành với các
nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi DNA khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lƣợng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi [13].
- Ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định S. aureus: David P. Kateete và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nhân gen nuc của S. aureus đƣợc sử dụng nhƣ kỹ thuật cơ bản, là tiêu chuẩn vàng để xác định S. aureus. Paola Cremonesi ứng dụng PCR đa mồi để xác định các gen cog, nuc, sea, seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej, sel. Kỹ thuật PCR đa mồi này có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật ELISA [30].
1.4.2.2. Kỹ thuật realtime PCR
Nguyên lý: Là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát hiện vừa định lƣợng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime nghĩa là đúng thời điểm). Đây là kỹ thuật phát hiện không đồng nhất, một hỗn hợp của sản phẩm PCR đƣợc phát hiện mà không phải từng thành phần đƣợc phát hiện nhƣ trong kỹ thuật điện di thông thƣờng [23].
Ưu điểm:
- Kiểm soát đƣợc lƣợng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định đƣợc lƣợng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ thuật PCR thông thƣờng, gel agarose có nhiều hạn chế nhƣ độ phân giải thấp do vậy định lƣợng thƣờng không chính xác.
- Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại.
- Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1 - 2 h trong khi PCR truyền thống phải mất từ 3 - 5h.
- Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm.
1.4.2.3. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism)
- Nguyên lý: Sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt sản phẩm PCR tạo nên những đoạn cắt khác nhau và xác định kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid.
- Ứng dụng kỹ thuật RFLP để xác định tính đa hình của gen đƣợc cắt. Ví dụ cắt bằng AluI xác định gen mã hóa coagulase của S. aureus. Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase [55].
1.4.2.4. Giải trình tự gen
Hai phƣơng pháp chính xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Phƣơng pháp của Sanger đƣợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu y sinh học [12]. Phƣơng pháp này dựa vào sự tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ xung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trƣng của phƣơng pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thƣờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3’OH đƣợc thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester, do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả phản ứng tạo ra các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm đƣợc đem phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả đƣợc đọc trên máy tự ghi [13].
1.4.3. Một số kỹ thuật dựa trên miễn dịch
1.4.3.1. Kỹ thuật ELISA
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) là kỹ thuật thực hiện trên đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng để phát hiện và định lƣợng peptide, protein, kháng thể và các phân tử sinh học. ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Nhược điểm: Phải thao tác trong phòng thí nghiệm; đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có trình độ chuyên môn, thao tác thí nghiệm chính xác; chi phí hoá chất xét nghiệm đắt tiền; mất nhiều thời gian.
Ứng dụng kỹ thật này để xác định độc tố ruột của S. aureus nhƣ SEA, SEB, SEC, SED… Đây là kỹ thuật đƣợc sử dụng từ vài thập kỷ trƣớc nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng, đặc biệt để xác định căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [8].
1.4.3.2. Kỹ thuật xác định bằng phage
Sử dụng các nhóm phage để xác định lysotyp S. aureus ở ngƣời: + Nhóm I: 29, 52, 52A, 79, 80.
+ Nhóm II: 3A, 3C, 55, 71.
+ Nhóm III: 6, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85. + Không xếp hạng: 81, 95, 96 [4].
1.4.3.3. Western Blot