Để đảm bảo cho việc gắn gen seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T đạt hiệu quả cao, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit tinh sạch của Bioneer. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Kết quả thu đƣợc sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đƣợc thể hiện trên hình 3.3 cho thấy một băng vạch gọn, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 534bp đúng theo lí thuyết khi thiết kế. Nhƣ vậy, kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đã đáp ứng đƣợc cho phản ứng gắn gen seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T.
3.2.3. Gắn đoạn gen đích seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T
Mục đích của việc tách dòng là tạo vector tái tổ hợp rồi chuyển vector tái tổ hợp này vào các tế bào chủ nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm.
Phản ứng ghép nối gen seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T đƣợc thực hiện với thành phần và các bƣớc nhƣ mục 2.2.6. Sau khi đã ghép nối gen
seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T, hỗn hợp này đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Tiếp theo, chúng tôi chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp rồi đem tách chiết DNA plasmid để kiểm tra. Sản phẩm tách DNA plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1%
1-5: Sản phẩm tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp từ 5 dòng khuẩn lạc ngẫu nhiên
Từ sản phẩm tách DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trên, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra sự tồn tại của đoạn gen đích trong vector tách dòng pTZ57R/T bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm cắt seb534/pTZ57R/T bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII
M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-4: Các plasmid mang gen seb534 tách từ các khuẩn lạc được xử lý với enzym EcoRI v HindIII
Kết quả thu đƣợc trên hình 3.6 cho thấy, các plasmid tách từ các khuẩn lạc đƣợc xử lý bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII sẽ cắt DNA plasmid tái tổ hợp thành hai đoạn có kích thƣớc khác nhau. Hai đoạn DNA sẽ tạo thành 2 băng vạch trên mỗi giếng điện di, một băng có kích thƣớc khoảng 534 bp tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen seb nghiên cứu và một băng có kích thƣớc khoảng 2900 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector tách dòng pTZ57R/T.
Kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã tách dòng thành công gen seb534 trong vector tách dòng pTZ57R/T. Để xác định đƣợc chính xác trình tự nucleotid gen
seb534 này, chúng tôi tiến hành đọc trình gen seb534 từ plasmid tái tổ hợp
seb534/pTZ57R/T.
3.2.4. Xác định trình tự gen seb534
Đoạn gen seb534 của chủng S. aureus nghiên cứu đƣợc xác định trình tự nucletide trên máy đọc tự động ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả xác định trình tự, đƣợc so sánh mức độ tƣơng đồng của gen seb534 ở chủng S. aureus nghiên cứu với những kết quả đã công bố trên ngân hàng gen thế giới - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả xác định và so sánh trình tự đƣợc trình bày ở hình 3.6 và bảng 3.1.
1 ccagatgagt tgcacaaagc gagtaaattc actggtttga tggaaaatat gaaagttttg 61 tatgatgata atcatgtatc agcaataaac gttaaatcta tagatcaatt tctatacttt 121 gacttaatat attctattaa ggacactaag ttagggaatt atgataatgt tcgagtcgaa 181 tttaaaaaca aagatttagc tgataaatac aaagataaat acgtagatgt gtttggagct 241 aattattact atcaatgtta tttttctaaa aaaacgaatg atattaattc acatcaaact 301 gacaaacgaa aaacttgtat gtatggtggt gtaactgagc ataatggaaa ccaattagat 361 aaatatagaa gtattactgt tcgggtattt gaagatggta aaaatttatt atcttttgac 421 gtacaaacta ataagaaaaa agtgactgct caagaattag attacctaac tcgtcactat 481 ttggtgaaaa ataaaaaact ctatgaattt aacaactcgc cttatgaaac ggga
Hình 3.6. Trình tự gen seb534 của chủng S. aureus
Bảng 3.1. Độ tƣơng đồng của gen seb534 ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)
TT Tên trình tự gen tƣơng đồng với gen seb Mã số trên
NCBI
Tỉ lệ tƣơng đồng (%)
1 Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity
island, strain: IVM10 AB716349.1 100%
2 Staphylococcus aureus strain F136 enterotoxin
B precursor (seb) gene, partial cds DQ997828.1 100% 3 Staphylococcus aureus partial seb gene for
staphylococcal enterotoxin B precursor (SEB) AM158256.1 100% 4 Staphylococcus aureus strain 339E enterotoxin
seb variant gene, partial cds AY196689.1 100%
5
Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity island SaPITokyo12413, complete sequence, strain: Tokyo12413
AB860415.1 99%
6 Staphylococcus aureus strain 2395 USA500,
Kết quả giải trình tự gen nghiên cứu trong vector tách dòng pTZ57R/T cho thấy, đoạn gen nghiên cứu chứa khoảng 534 nucleotide, có tỷ lệ tƣơng đồng cao với các gen seb đã công bố trên ngân hàng gen. Tỷ lệ tƣơng đồng 100% với gen seb mã số AB716349.1, DQ997830.1, AM158256.1 và AY196689.1 trên ngân hàng gen quốc tế; tƣơng đồng 99% với gen seb mã số AB860416.1, CP003166 và nhiều mã số khác trên ngân hàng gen quốc tế.
Kết quả trên cho thấy, các dòng tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α đã mang plasmid tái tổ hợp seb534/pTZ57R/T mã hóa cho kháng nguyên SEB.
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22(b+) mang gen seb534
3.3.1. Xử lý enzym cắt hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb534 và vector pET22(b+)
Dựa trên kết quả nghiên cứu bản đồ cắt giới hạn của gen seb534, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET22(b+) và vector tách dòng pTZ57R/T, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII không có trong trình tự gen seb534, có trong vùng đa tách dòng vector pET22(b+), pTZ57R/T. Chính vì vậy, khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII vào hai đầu đoạn gen
seb534 (đầu 5’ và đầu 3’). Hai enzym này sẽ tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng.
Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành cắt seb534 bằng hai enzym
EcoRI và HindIII nhƣ mô tả ở mục 2.2.7. Sản phẩm PCR sau khi cắt tạo đầu sole bằng hai enzym đƣợc tinh sạch theo quy trình của bộ kit Thermo Scientific (Mỹ) và đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; 1: Sản phẩm cắt mở vòng seb534
Kết quả điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch chỉ xuất hiện một vạch duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 534 bp. Nhƣ vậy, sản phẩm sau khi tinh sạch có độ tinh sạch cao đủ điều kiện để ghép nối vào vector biểu hiện pET22(b+) ở các thí nghiệm tiếp theo.
Bƣớc tiếp theo, cắt mở vòng plasmid pET22(b+) cũng bằng hai enzym EcoRI và HindIII trong 3 giờ ở 37oC để tạo đầu sole tƣơng tự nhƣ đối với gen seb534 phục vụ cho việc ghép nối đoạn gen seb534 vào vector pET22(b+). Sản phẩm cắt đƣợc tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt mở vòng plasmid pET22(b+) đƣợc thể hiện trong hình 3.8.
Hình 3.8. Điện di đồ plasmid pET22(b+) sau khi cắt bằng các enzym hạn chế
Kết quả điện di đồ cho thấy, vector sau khi mở vòng bằng hai enzym hạn chế trên là một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 5500 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pET22(b+) nhƣ trong lý thuyết.
3.3.2. Gắn đoạn gen đích seb534 vào vector biểu hiện pET22(b+)
Vector pET22(b+) sau khi cắt mở vòng, tạo đầu sole bằng enzym hạn chế và tinh sạch sẽ đƣợc ghép nối với gen đích seb534 tạo thành vector tái tổ hợp
seb534/pET22(b+) nhờ xúc tác của enzym T4 DNA ligase. Thành phần phản ứng ghép nối nhƣ mục 2.2.8.
Sản phẩm ghép nối là vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3). E. coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thƣờng đƣợc sử dụng khi biểu hiện 1 protein lạ, phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 nhƣ vector pET22(b+). Hơn nữa chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) đã đƣợc biến đổi để tăng cƣờng khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tƣợng và mục đích nghiên cứu của đề tài. Thành phần phản ứng, các bƣớc tiến hành biến nạp nhƣ mô tả ở mục 2.2.9.
Sau khi biến nạp thành công vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, dịch khuẩn đƣợc cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/ml. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện trên hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3)
Kết quả của quá trình nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa kháng sinh chọn lọc cho thấy, trên đĩa thạch có nhiều khuẩn lạc phát triển. Tuy nhiên, không biết khuẩn lạc nào mang vector tái tổ hợp.
Bản thân các tế bào E. coli BL21(DE3) không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin, khả năng kháng kháng sinh ampicillin có đƣợc là từ vector pET22(b+) hoặc vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Do đó, sau khi biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối ghép và nuôi cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100 mg/ml sẽ có các trƣờng hợp sau xảy ra:
1. Các tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc đƣợc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh ampicillin.
2. Các tế bào khả biến chỉ chứa vector biểu hiện tự đóng vòng (do một trong 2 enzym cắt không hoàn toàn), có gen kháng kháng sinh nên vẫn tồn tại và tạo khuẩn lạc.
3. Các tế bào khả biến có chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) có gen kháng kháng sinh nên mọc đƣợc trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc.
Để đảm bảo độ chính xác của các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra một số khuẩn lạc trên đĩa thạch theo hai cách là: PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu và tách DNA plasmid cắt kiểm tra bằng hai enzym hạn chế đã đƣợc sử dụng để cắt mở vòng gen và vector.
3.3.3. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+)
3.3.3.1. Chọn lọc bằng phản ứng colony-PCR
Để kiểm tra khuẩn lạc của dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp
seb534/pET22(b+), chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR). Các bƣớc tiến hành, thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ mô tả ở mục 2.2.3. Kết quả sau khi tiến hành colony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+)
M: Thang DNA chuẩn 1 kb;
1-4: Sản phầm colony-PCR từ các dòng khuẩn lạc khác nhau; (-): Đối chứng âm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, ở 4 giếng (giếng 1, 2, 3, 4 - tƣơng ứng với 4 dòng khuẩn lạc) đều xuất hiện một băng DNA có kích thƣớc khoảng 534 bp phù hợp với kích thƣớc gen seb534 theo tính toán lý thuyết. Kết quả trên cho thấy, cả 4 dòng khuẩn lạc trên đều chứa plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Để kết quả chắc chắn hơn, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid và cắt bằng hai enzym hạn chế kiểm tra plasmid của các dòng khuẩn lạc nói trên.
3.3.3.2. Chọn lọc bằng phương pháp enzym hạn chế
Phƣơng pháp này cho kết quả với độ chính xác cao hơn. Chúng tôi tiến hành tách và cắt kiểm tra plasmid của 4 dòng khuẩn lạc trên bằng chính 2 enzym đã sử dụng để cắt mở vòng là EcoRI và HindIII. Thành phần phản ứng và các bƣớc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 2.2.10 và 2.2.7. Sản phẩm xử lí plasmid tái tổ hợp các dòng bằng enzym hạn chế đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid seb534/pET22(b+) của các dòng khuẩn lạc
M: Thang DNA chuẩn 1 kb;
1-4: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc khác nhau.
Kết quả điện di đồ cho thấy: sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp
seb534/pET22(b+) bằng enzym hạn chế sau khi điện di trên cả 4 giếng (giếng 1, 2, 3, 4 - tƣơng ứng với 4 dòng khuẩn lạc) đều xuất hiện 2 băng DNA: băng phía trên có kích thƣớc khoảng 5500 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pET22(b+); băng phía dƣới có kích thƣớc khoảng 534 bp phù hợp với kích thƣớc gen seb534
theo tính toán lý thuyết. Từ kết quả trên chúng tôi nhận định: đoạn gen đích seb534
đã đƣợc gắn thành công vào vector biểu hiện pET22(b+); cả 4 dòng khuẩn lạc trên đều chứa plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+). Nhƣ vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện seb534/pET22(b+).
3.4. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 trong tế bào E. coli
BL21(DE3)
3.4.1. Biểu hiện gen seb534 trong tế bào E. coli BL21(DE3)
Tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) sau khi biến nạp thành công vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) sẽ đƣợc nuôi trong môi trƣờng có chứa kháng sinh chọn lọc Ampicillin và chất cảm ứng là IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside). Gen đích seb534 trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG có trong môi trƣờng.
Theo tính toán lý thuyết, protein đích SEB534 đƣợc biểu hiện sẽ có khối lƣợng phân tử khoảng 22 kDa.
Quy trình biểu hiện gen seb534 trong tế bào khả biến E. coliBL21(DE3) đƣợc tiến hành theo mô tả ở mục 2.2.12. Để kiểm tra chất lƣợng và tính chất của protein đích (protein ở dạng tan hay không tan) chúng tôi tiến hành nuôi cảm ứng ở 28oC, 30oC; sinh khối tế bào đƣợc siêu âm trong đệm PBS, ly tâm thu pha dịch và pha cặn, sau đó tiến hành điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện protein SEB534
1: Protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc seb534/pET22(b+)/BL21 không được cảm ứng IPTG.
2: Protein tổng số pha tan ở 30oC; 3: Protein tổng số pha không tan ở 30oC; 4: Protein tổng số pha tan ở 28o
C; 5: Protein tổng số pha không tan ở 28oC; M: Thang chuẩn protein
Kết quả trên hình cho thấy: ở giếng 1 không xuất hiện băng protein SEB có kích thƣớc 22 kDa do dòng này không đƣợc cảm ứng IPTG. Các giếng 2, 3, 4 và 5 đều xuất hiện băng protein có kích thƣớc khoảng 22 kDa phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của protein SEB534 do đƣợc cảm ứng IPTG. So sánh kết quả thu đƣợc ở giếng 2 với giếng 3 và giếng 4 với giếng 5, chúng tôi thấy protein SEB534 đƣợc biểu hiện chủ yếu nằm ở pha không tan.
Để cải thiện tính tan và thu đƣợc lƣợng protein SEB534 tốt nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi biểu hiện đến khả năng biểu hiện của gen seb534 trong tế bào khả biến E. coli BL21(DE3).
3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534
Rất nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng, protein vật chủ, thành phần và nồng độ các chất dinh dƣỡng… làm ảnh hƣởng đến sự tổng hợp protein SEB trong tế bào khả biến E. coli BL21(DE3). Cho nên việc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho tổng hợp protein ngoại lai là điều rất quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát yếu tố nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cảm ứng để thu đƣợc lƣợng protein SEB tốt nhất phục vụ cho nghiên cứu.
3.4.2.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn và khá phức tạp đến sự tổng hợp protein tái tổ hợp trong tế bào chủ. Thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, nhiệt độ này không hẳn đã là nhiệt độ thích