Nguyên lý:
Mục đích của việc tách dòng là tạo vector tái tổ hợp rồi chuyển vector tái tổ hợp này vào các tế bào chủ nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Trong luận văn này DNA ngoại lai là seb534 đƣợc nối vào vector pTZ57R/T nhằm tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Sau đó, vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α.
Việc ghép nối phải dựa trên cơ sở cấu trúc của plasmid pTZ57R/T đƣợc thể hiện trên hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T
Tiến h nh:
1. Thiết lập phản ứng nối gồm các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (l) Đệm nối (5X) 6 Sản phẩm PCR 4 Vector pTZ57R/T 3 Nƣớc khử ion 16 Enzym T4 DNA 1 Tổng thể tích 30
2. Đảo trộn nh và ly tâm trong 3 đến 5 giây. 3. Ủ hỗn hợp phản ứng 22o
C trong 1 giờ.
4. Sau khi phản ứng kết thúc lấy 5 l ở mỗi phản ứng tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42oC trong 40 giây, đặt ngay vào đá trong 20 phút rồi bổ sung môi trƣờng LB dịch để nuôi ở 37 oC trong 1 giờ.
5. Sản phẩm sau biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng thạch đĩa LB có bổ sung Ampicillin (tỉ lệ LB dịch : Amp = 1000 : 1).
6. Nuôi tĩnh ở 37oC qua đêm.
2.2.7. Phương pháp xử lý enzym hạn chế trên gen seb và vector biểu hiện pET22b(+)
Nguyên lý:
Enzym hạn chế - Restriction enzym là các endonuclease nội bào có khả năng nhận biết và cắt các đoạn DNA tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Các enzym này phá vỡ các liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases.
Trong nghiên cứu này sử dụng hai enzym hạn chế là: EcoRI và HindIII, với mục đích:
1. Tạo đầu cắt sole cho gen seb534 sau khi đã đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pTZ57R/T;
2. Mở vòng vector biểu hiện pET22b(+) sử dụng cho phản ứng nối với gen
seb534;
3. Kiểm tra vector tái tổ hợp pET22b(+) mang gen seb534 tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi chuyển vector tái tổ hợp vào chủng biểu hiện.
Để gen đích seb534 biểu hiện thành sản phẩm protein thì phải đƣa gen đích vào vector biểu hiện mang các cấu trúc cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã. Các trình tự quan trọng nhất trợ giúp cho quá trình biểu hiện gen đích là: (1) promoter, (2) terminator, (3) trình tự điều hòa (regulator). Trong nghiên cứu này, dựa trên kích thƣớc của đoạn gen đích, yêu cầu của vector biểu hiện chúng tôi đã sử dụng vector pET22(b+) làm vector biểu hiện.
Vector biểu hiện pET22b(+) (hình 2.3) là vector đƣợc thiết kế cho biểu hiện các gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli với nhiều ƣu điểm. Vector pET22(b+) là vector biểu hiện mạnh có kích thƣớc khoảng 5500 bp, mang trình tự peIB ở đầu N’ tại vị trí 224 đến 289 và trình tự His-tag ở đầu C’ tại vị trí 140 đến 157. Vector pET22(b+) chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu quá trình phiên mã và kết thúc quá trình dịch mã. Trình tự peIB và His-tag có chức năng cung cấp điểm đầu dịch mã và kết thúc quá trình dịch mã cũng nhƣ tinh sạch protein bằng liên kết ái lực. Vector biểu hiện có gen kháng ampicillin thuận lợi cho quá trình chọn lọc dòng vi khuẩn sau này. Vector biểu hiện có trình tự rbs (ribosome binding site - vị trí liên kết ribosome) đƣợc thiết kế ở giữa vị trí của promoter và đoạn gen đƣợc chèn vào.
Hình 2.3. Cấu trúc vertor biểu hiện pET22(b+)
(Nguồn:https://www.addgene.org/12651/)
Về cơ bản, thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau là thể tích của các thành phần sẽ đƣợc điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và DNA mẫu.
Tiến h nh:
Phản ứng cắt mở vòng vector pET22b(+) đƣợc thực hiện với các thành phần nhƣ sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng NEBuffer 4
Enzym EcoRI(20 U/µl) Enzym HindIII(20 U/µl) Plasmid pET22b(+) 4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb534 sau khi đã đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pTZ57R/T đƣợc thực hiện với các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng Đệm 4 (10 X)
Enzym EcoRI (20 U/µl) Enzym HindIII (20 U/µl) Sản phẩm PCR 4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET22b(+) mang gen seb534 tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21 thực hiện với các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng Đệm 4 (10 X)
Enzym EcoRI (20 U/µl) Enzym HindIII (20 U/µl) Vector seb534/pET22b(+)
4 2 1 1 12 Tổng thể tích 20
Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn với tỉ lệ sử dụng theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất. Hỗn hợp đƣợc ủ trong 2 giờ ở 37°C, sau đó bất hoạt enzym ở 85oC trong 20 phút, lấy ra đặt ngay vào đá trong 2 phút. Sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.8. Phương pháp ghép nối gen ngoại lai vào vector pET22b(+)
Nguyên lý:
Enzym T4 ligase đƣợc tách chiết từ các tế bảo E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4. Enzym này có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm OH ở đầu 3’ và nhóm phosphat đầu 5’ trên mạch DNA hoặc RNA. Vector biểu hiện tái tổ hợp đƣợc thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET22b(+) sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.
Tiến h nh: Thành phần phản ứng nối ghép gen nhƣ sau:
Thành phần Thể tích Buffer 5x 4 µl DNA plasmid 3 µl Đoạn chèn DNA 9 µl T4 ligase 2,5 µl Nƣớc khử ion 1,5 µl Tổng thể tích 20 µl
Trộn hỗn hợp phản ứng cẩn thận và ủ trong 2 giờ ở 22°C. Sau khi kết thúc, hỗn hợp đƣợc dùng để biến nạp hoặc lƣu giữ ở tủ -20oC.
2.2.9. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Nguyên lý:
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và BL21 theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phƣơng pháp là E. coli đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, sử dụng sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ để tác động lên cấu trúc thành tế bào, tạo điều kiện cho DNA ngoại lai đi vào trong tế bào.
2.2.10. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli DH5α
Nguyên lý:
Kiềm và các chất tẩy mạnh (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính các phân tử protein. Các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng li tâm tốc độ cao. DNA plasmid đƣợc thu lại bằng cách kết tủa với ethanol hoặc isopropanol.
2.2.11. Xác định trình tự acid nucleic
Nguyên lý:
Phân đoạn chèn trong plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch sẽ đƣợc giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide đƣợc xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và không gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide.
Plasmid nhân dòng pTZ57R/T/SEB đƣợc dùng làm khuôn chạy PCR để đọc trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Phần mềm Bioedit và BLAST đƣợc sử dụng phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid.
2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen seb trong chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3)
Nguyên lý:
E. coli BL21(DE3) đƣợc lựa chọn là chủng biểu hiện gen seb534 để sinh tổng hợp protein SEB. E. coli BL21(DE3) mang gen mã hóa enzym T7 ARN polymerase trong genome. Trong môi trƣờng có IPTG, enzym T7 ARN polymerase đƣợc kích hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất protein SEB.
Tiến h nh:
Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 10 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 10 µl Ampicillin 100 mg/l ở nhiệt độ 37oC, lắc 200 v/p qua đêm.
1. Hoạt hóa tế bào: Lấy 2 - 3% dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 50 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50 µl Ampicillin 100 mg/ml, nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong 1 - 1,5 giờ sao cho OD600= 0,6 - 0,8 thì tiến hành cảm ứng biểu hiện.
2. Bổ sung IPTG ở các nồng độ 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM vào dịch khuẩn thu đƣợc, nuôi lắc 220 v/p ở các nhiệt độ khác nhau 20oC, 28oC, 37oC trong khoảng thời gian từ 0 giờ đến 5 giờ.
3. Thu mẫu cho vào ống falcon 50ml, ly tâm 5000 v/p trong 10 phút, loại dịch thu cặn.
4. Hòa tan cặn bằng đệm PBS 1X, voltex đặt vào đá trong 15 phút, tiến hành siêu âm.
5. Siêu âm phá tế bào trong đá, chế độ siêu âm 20 giây chạy : 20 giây nghỉ, trong 15 phút.
6. Chia dịch phá tế bào sau siêu âm ra các eppendorf 1,5 ml, ly tâm 12.000 v/p ở 4oC trong 15 phút.
7. Thu dịch vào falcon 15 ml, cặn thu vào các epp.
8. Kết quả đƣợc điện di trên gel polyacrylamide (SDS - PAGE) để tiến hành kiểm tra.
2.2.13. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Nguyên lý:
Năm 1970, Laemmli đƣa ra phƣơng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích thƣớc, khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng.
Các phân tử protein trong môi trƣờng có SDS sẽ bị duỗi thẳng và trở nên tích điện âm, khi đƣợc đặt trong một điện trƣờng chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng với tốc độ phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của chúng.
Thực hiện:
Bản gel polyacrylamide đƣợc đổ hai lớp:
- Lớp dƣới là gel tách đƣợc đổ cách mặt trên 1 - 1,5 cm, để đông 30 phút. - Lớp trên là gel cô, đổ lên trên lớp gel tách, cài lƣợc tạo giếng, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn và ổn định.
Thành phần gel polyacrylamide nhƣ bảng 2.5 và 2.6. Bảng 2.5. Thành phần gel tách 12% Bảng 2.6. Thành phần gel cô 5% Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12% Thể tích (ml) dH2O vô trùng 2,45 Acrylamid 30% 12% 3,00 Tris-HCl5M; pH=8,8 0,375 M 1,90 SDS 10% 0,1% 0,075 APS 10% 0,1% 0,075 TEMED 0,002% 0,003 Tổng thể tích 7,503 Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 5% Thể tích (ml) dH2O vô trùng 2,1 Acrylamid 30% 5 % 0,5 Tris-HCl1M; pH=6,8 0,13 M 0,38 SDS 10% 0,1% 0,03 APS 10% 0,1% 0,03 TEMED 0,001% 0,003 Tổng thể tích 3,043
Sau khi pha xong gel polyacrylamide chúng tôi tiến hành tiếp các bƣớc sau:
- Biến tính hỗn hợp: protein + Sample Buffer 5X trƣớc khi điện di bằng sốc nhiệt 95oC trong 10 phút rồi cắm ngay vào đá.
- Bản điện di đƣợc lắp vào hệ thống điện di, tra mẫu vào giếng của bản gel và chạy 80V trong 30 phút đầu với gel cô, 100V trong 65 phút đối với gel tách.
- Gỡ gel, nhuộm lắc 2 giờ trong dung dịch Staining.
- Rửa nhuộm trong dung dịch De-Staining 2 lần, lần 1 rửa nhuộm 45 phút, lần 2 rửa nhuộm trong 30 phút.
- Soi dƣới đèn và chụp lại kết quả.
2.2.14. Phương pháp tinh sạch protein
Nguyên lý:
Protein SEB534 tái tổ hợp chứa các gốc histidine đƣợc tinh sạch bằng hệ thống cột resin gắn nickel. Cột resin-nickel có ái lực cao với các protein chứa 6 gốc histidine nhƣ SEB534 tái tổ hợp. Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và His trong phân tử protein, liên kết với resin đƣợc thôi bằng đệm pH thấp hoặc bằng muối imidazole.
Thực hiện:
1. Loại bỏ dịch bảo quản trong cột Ni-NTA.
2. Bổ sung 8 ml dịch phá protein vào cột tinh sạch, đảo nh , giữ resin lơ lửng trong dịch phá 1 giờ.
3. Lắng resin bằng trọng lực, thu dịch qua cột, ký hiệu part 1, giữ ở 40C. 4. Bổ sung 7 ml đệm rửa (Urea 6 M; Na2HPO4.12H2O 20 mM; Na2HPO4.2H2O 20 mM; NaCl 50 mM; định mức 200 ml nƣớc deion, pH = 7,8; lọc qua màng, không khử trùng), đảo đều, làm lơ lửng resin, lắng resin, thu dịch qua cột (ký hiệu part 2).
6. Bổ sung 6 ml đệm đẩy (Imidazol 0,4 M; urea 6 M; NaH2PO4 200 mM; Na2HPO4 200 mM; NaCl 500 mM, định mức 200 ml mƣớc deion, pH = 8; lọc qua màng, không khử trùng), thu 4 phân đoạn, ký hiệu lần lƣợt: 1, 2, 3, 4.
7. Các dịch nổi (phân đoạn) thu đƣợc sau tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide.
Chƣơng III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus
Kết quả tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn S. aureus phân lập ở Thái Nguyên đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Sản phẩm tách DNA tổng số của chủng S. aureus 1 2: Sản phẩm tách DNA tổng số của chủng S. aureus
Kết quả kiểm tra sau khi tiến hành điện di trên gel agarose 1% cho thấy: cả 2 giếng đều cho một băng DNA sáng, rõ nét và sạch đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen seb534 bằng phƣơng pháp PCR.
3.2. Tách dòng gen seb534
3.2.1. Nhân gen seb534 từ chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
Mục đích của chúng tôi là nhân đƣợc gen đích seb534 với kích thƣớc khoảng 534 bp bằng phản ứng PCR. Dựa vào trình tự gen seb trên ngân hàng gen, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen seb có kích thƣớc 534 bp nhƣ bảng 2.1. Thành phần phản ứng, các bƣớc tiến hành và chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhƣ mục 2.2.2. Sau khi tiến hành PCR chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc thể hiện nhƣ trong hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 M: Thang DNA chuẩn 100 bp;
1 2: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534; (-): đối chứng âm.
Kết quả điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 cho thấy:
- Giếng (-) là đối chứng âm (mẫu có chứa đầy đủ các thành phần của phản ứng PCR, chỉ khác là thay mẫu DNA bằng nƣớc khử ion) không cho một băng nào. Điều này chứng tỏ quá trình thao tác thực hiện chính xác, không bị nhiễm DNA lạ.
- Giếng 1 và 2 là sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 của chủng vi khuẩn S.aureus
với cặp mồi đặc hiệu SEB Exp - R và SEB Exp - F cho kết quả là một băng vạch gọn, rõ nét và có kích thƣớc khoảng 534bp đúng theo tính toán lý thuyết của cặp mồi thiết kế. Do đó, sản phẩm này đƣợc chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR
Để đảm bảo cho việc gắn gen seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T đạt hiệu quả cao, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit tinh sạch của Bioneer. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Kết quả thu đƣợc sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đƣợc thể hiện trên hình 3.3 cho thấy một băng vạch gọn, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 534bp đúng theo lí thuyết khi thiết kế. Nhƣ vậy, kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đã đáp ứng đƣợc cho phản ứng gắn gen seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T.
3.2.3. Gắn đoạn gen đích seb534 vào vector tách dòng pTZ57R/T
Mục đích của việc tách dòng là tạo vector tái tổ hợp rồi chuyển vector tái tổ