- Dựa vào kết quả kiểm nghiệm và đề xuất tiờu chuẩn chất lượng, xõy dựng được tiờu chuẩn cơ sở của viờn nộn DIL GPTN (phụ lục 5) và chế phẩm
4.3.1.Về xõy dựng và thẩm định phƣơng phỏp định lƣợng Diltiazem trong huyết tƣơng chú
5 (phỳt) 1 (phỳt) 30 (phỳt) 4 (phỳt) 60 (phỳt)
4.3.1.Về xõy dựng và thẩm định phƣơng phỏp định lƣợng Diltiazem trong huyết tƣơng chú
trong huyết tƣơng chú
Cỏc nghiờn cứu về định lượng DIL trong dịch sinh học thường sử dụng phương phỏp HPLC với detector UV, huỳnh quang [23], khối phổ,…. Phương phỏp này cú độ chớnh xỏc cao và xỏc định được lượng DIL ở nồng độ thấp và rất phự hợp cho định lượng DIL trong dịch sinh học. Tuy nhiờn, với detector huỳnh quang, điều kiện tiến hành rất phức tạp, thiết bị này cú ớt ở Việt Nam. Viờn GPTN được đặc trưng bởi Tlag . Trong giai đoạn Tlag, viờn giải phúng DC rất ớt (<10%) nờn nồng độ DC trong huyết tương rất thấp. Đề tài luận ỏn sử dụng phương phỏp HPLC-MS/MS, vỡ phương phỏp này cú khả năng phỏt hiện lượng dược chất cú nồng độ rất thấp trong huyết tương. Ngoài ra, phương phỏp phõn tớch bằng HPLC-MS/MS cũn cú ưu điểm về độ phõn giải, độ chọn
lọc, phự hợp với phõn tớch cỏc DC cú lẫn nhiều tạp chất như trong huyết tương.
Khi chiết DIL trong huyết tương, cỏc tỏc giả thường sử dụng cỏc phương phỏp như: chiết pha rắn, chiết lỏng-lỏng, tủa protein huyết tương. Với phương phỏp tủa protein: Cỏc tỏc giả sử dụng cỏc tỏc nhõn gõy tủa protein như: (acid tricloroacetic, acid percloric, MeOH, MeCN,..) để làm đụng vún protein trong mẫu huyết tương. Tuy nhiờn, một số chất phõn tớch dễ hỏng bởi acid. Ngoài ra, DC chiết được cú độ tinh khiết khụng cao, nờn cường độ dũng ion tạo thành khụng ổn định và cú sự suy giảm tớn hiệu ở đầu dũ khối phổ ảnh hưởng đến độ chớnh xỏc của kết quả định lượng. Với phương phỏp chiết pha rắn, là phương phỏp tỏch riờng chất cần phõn tớch ra khỏi cỏc tạp cú trong nền mẫu, dựa trờn sự khỏc nhau về ỏi lực của chất cần phõn tớch và cỏc tạp chất đối với pha động (dạng lỏng) và pha tĩnh (dạng rắn). Mẫu được đưa vào pha tĩnh, dựng dung mụi thớch hợp để rửa giải tạp chất ra trước trong khi chất cần phõn tớch vẫn cũn được lưu giữ trờn cột hoặc ngược lại. Sau đú, rửa giải chất phõn tớch cũn lưu giữ trờn cột bằng dung mụi thớch hợp. Phương phỏp này cú thể làm cụ đặc mẫu, làm tăng nồng độ DIL trong mẫu định lượng và cú thể phỏt hiện được cỏc mẫu cú nồng độ thấp. Tuy nhiờn, qui trỡnh diễn ra với nhiều cụng đoạn cú thể làm tăng sai số của quỏ trỡnh phõn tớch. Đặc biệt, chiết pha rắn cần cú cỏc cột chứa chất mang tương đối đăt tiền.
Trong đề tài luận ỏn, sử dụng phương phỏp chiết lỏng-lỏng: Mẫu được kiềm hoỏ bằng dung dịch amoniac 0,1M, chiết bằng hỗn hợp dung mụi diethylether – cloroform (7:3), lắc 10 phỳt, ly tõm, lấy lớp dung mụi và bốc hơi dưới dũng khớ nitrogen thu cắn, thể tớch tiờm mẫu là 10 àl. Kết quả định lượng được cỏc mẫu cú nồng độ thấp cỡ nanogam/ml (giới hạn định lượng dưới là 4,8 ng/ml). Mặt khỏc, đó khắc phục được nhược điểm pha loóng mẫu của phương phỏp kết tủa protein huyết tương. Tốc độ dũng 0,3 ml/phỳt được
lựa chọn. Tốc độ này cho thời gian lưu của pic DIL ngắn, pic cõn đối, tạo điều kiện cho phõn tớch định lượng nhiều mẫu trong cựng 1 ngày.
Kiểu khối phổ được lựa chọn là MS/MS với nguồn ion húa ESI (+), mảnh phổ khối m/z = 414,5177,8 (DIL) và m/z = 383,4338,1 (FELO), Cỏc pic DIL và FELO ở cỏc mẫu LLOQ đều cú tỷ lệ S/N > 500.
Do nồng độ DC trong dịch sinh học thấp, DIL bị chuyển hoỏ qua gan lần đầu mạnh, nờn nồng độ trong huyết tương rất thấp. Quỏ trỡnh thẩm định phương phỏp là quỏ trỡnh xỏc định độ tin cậy của phộp đo nồng độ DC trong dịch sinh học một cỏch chớnh xỏc. Quỏ trỡnh thẩm định theo qui định của FDA được tiến hành đầy đủ theo 6 tiờu chớ. Kết quả cho thấy: Phương phỏp phõn tớch DIL đạt tiờu chuẩn của phương phỏp định lượng DC trong dịch sinh học.
Tớnh phự hợp của hệ thống sắc ký được kiểm tra bằng cỏch tiờm 6 lần mẫu dung dịch chuẩn DIL cú nồng độ 400 ng/ml vào hệ thống HPLC- MS/MS. Kết quả cho thấy: Cỏc giỏ trị RSD của thời gian lưu và diện tớch pic đều nhỏ hơn 2%. Khoảng tuyến tớnh được khảo sỏt theo dóy nồng độ từ 4,8- 478,7 ng/ml. Kết quả cho thấy: Cú sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tớch pic (R2=0,9975≈1). Nồng độ cao nhất của đường chuẩn được xỏc định dựa trờn nồng độ cực đại (Cmax) khi định lượng DIL trong huyết tương chú. Nồng độ Cmax thực tế của DIL trong huyết tương chú của thuốc thử và thuốc chứng xấp xỉ bằng 300 ng/ml. Do đú, cận trờn của đường chuẩn là phự hợp.
Về giới hạn định lượng, so với phương phỏp HPLC (cú giới hạn định lượng dưới từ 10-120 ng/ml) phương phỏp HPLC-MS/MS đó xõy dựng trong nghiờn cứu này cú giỏ trị giới hạn định lượng dưới thấp hơn nhiều. So với đa số cỏc phương phỏp định lượng DIL bằng HPLC dựng detector huỳnh quang, giới hạn định lượng của phương phỏp này cú giỏ trị gần bằng giỏ trị LOD hoặc LLOD, nhưng cao hơn so với phương phỏp của Bialer M. và cộng sự [16] cú giới hạn định lượng dưới là 1 ng/ml. Tuõn thủ theo hướng dẫn thẩm
định phương phỏp của FDA, giỏ trị LLOD của phương phỏp HPLC-MS/MS (4,8 ng/ml) đó được chứng minh bằng thực nghiệm. Độ đỳng, độ chớnh xỏc của phương phỏp phõn tớch DIL trong huyết tương bằng kỹ thuật HPLC- MS/MS đỏp ứng được cỏc yờu cầu đối với một phương phỏp phõn tớch trong dịch sinh học.
Sau khi lấy mẫu, cỏc mẫu huyết tương chú được bảo quản ở nhiệt độ - 350C cho đến trước khi định lượng. Trong hướng dẫn của FDA, yờu cầu phải xỏc định hiệu suất chiết của phương phỏp khụng cần phải là 100%. Hiệu suất chiết khụng nờn cao quỏ hoặc thấp quỏ, nhưng sự cần thiết phải cú độ lặp cao. Hiệu suất chiết của phương phỏp ở 3 nồng độ LQC; MQC; HQC đều là trờn 50 % (từ 74,1-78,6%) và cú độ lặp lại tốt thể hiện ở cỏc giỏ trị RSD đều nhỏ hơn 5% (từ 1,1-2,8%).
Cỏc mẫu huyết tương chú đều được bảo quản trong tủ lạnh sõu -35°C. Vỡ thế, thời gian theo dừi độ ổn định của mẫu phõn tớch phải lớn hơn thời gian dự kiến sẽ bảo quản thực (độ ổn định thời gian dài) và ổn định mẫu trong thời gian chờ xử lý mẫu (độ ổn định thời gian ngắn). Mẫu sau khi ró đụng nhưng khụng được xử lý ngay, mà đem đụng trở lại ở nhiệt độ -350C trong thời gian 12 giờ, nờn phải theo dừi độ ổn định mẫu sau 3 chu kỳ đụng – ró đụng.
Đỏnh giỏ độ ổn định thời gian dài của DIL căn cứ vào dự định cỏc mẫu huyết tương chú sẽ được định lượng hết trong vũng 1 thỏng sau khi lấy mẫu, nờn thiết kế thử nghiệm trong vũng 30 ngày. Cũn thụng thường, cỏc mẫu huyết tương lấy từ bảo quản lạnh -350
C ra, khoảng sau 0-4 giờ tan chảy, cỏc mẫu được xử lý mẫu hết và đem đi định lượng ngay. Phương phỏp phõn tớch được thẩm định và đạt yờu cầu theo qui định. Kết quả trờn cho phộp xõy dựng được phương phỏp khi tiến hành nghiờn cứu SKD trờn chú thực nghiệm.