Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phƣơng pháp của Bộ môn Bệnh lý thú y, trƣờng Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. Các bƣớc của quá trình làm tiêu bản vi thể nhƣ sau:
Cố định bệnh phẩm:
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lƣợt các bƣớc sau:
- Rửa formol: Rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ trong 24h. - Đƣa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động bao gồm 12 bình
Bình Hoá chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600 C 1:00 2 Cồn 600 C 1:00 3 Cồn 700 C 1:30 4 Cồn 800 C 1:30 5 Cồn 960 C 1:30 6 Cồn 1000 C 1:30 7 Cồn 1000 C 1:30 8 Cồn 1000 C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 Đúc block
Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin
Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom
Tãi mảnh: Tãi lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nƣớc ấm 480C. Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm đƣợc.
Nhuộm tiêu bản
Các bƣớc tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 6h
Xylen II : 6h Xylen III : 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dƣới vòi nƣớc chảy 15 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nƣớc. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào) Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 – 10 phút, rửa nƣớc. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000
mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.