3.5.1. Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm
Tiến hành nghiên cứu trên 10 con lợn giống Landrace 6 tuần tuổi, chia làm 2 lô: Lô thí nghiệm gồm 5 con và lô đối chứng gồm 5 con.
Thí nghiệm: Địa điểm thí nghiệm tại chuồng nuôi động vật thí nghiệm đặt tại nhà khoa Thú y. Chuồng nuôi đƣợc vệ sinh sạch sẽ, phun thuốc sát trùng định kỳ để tránh lây nhiễm mầm bệnh ra bên ngoài.
Trƣớc khi gây bệnh thực nghiệm, theo dõi nhiệt độ, tình trạng sức khỏe lợn thí nghiệm trƣớc khi gây nhiễm 2 ngày. Tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể PRRS bằng phƣơng pháp ELISA, đồng thời kiểm tra sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phƣơng pháp RT – PCR để khẳng định lợn thí nghiệm chƣa từng tiếp xúc với virus PRRS.
Mỗi lợn đƣợc gây bệnh bằng chủng PRRS – CG-03 với liều 106TCID50/3 ml/con, bơm qua xoang mũi. Sau khi gây bệnh, theo dõi lợn hàng ngày, đo thân nhiệt 2 lần/ ngày vào 9h và 17h. Sau khi gây bệnh sẽ lấy máu, dịch swab, phân kiểm tra sự có mặt của virus bằng phƣơng pháp RT – PCR, đồng thời tiến hành lấy máu đếm số lƣợng bạch cầu kiểm tra hàm lƣợng kháng thể vào ngày thứ 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 28.
Tiến hành mổ khám lợn khi lợn thí nghiệm chết hoặc kết thúc thí nghiệm (28 ngày sau gây nhiễm). Khi mổ khám, kiểm tra bệnh tích đại thể, làm tiêu bản bệnh lý nhuộm HE quan sát bệnh tích vi thể .
3.5.2. Phƣơng pháp ELISA
Trƣớc khi làm phản ứng ELISA chuẩn bị các dụng cụ của bộ kít ELISA đƣợc lấy ra để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Sau đó tiến hành phản ứng ELISA theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất Kít bao gồm các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Bổ sung 100µl mẫu pha loãng trong DWP (Deep-well-plate) vào trong các giếng.
Bƣớc 2: Bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dƣơng và đối chứng âm vào các giếng xác định.
Bƣớc 3: Ủ tấm kháng nguyên trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 220C-270C. Bƣớc 4: Rửa tấm phủ kháng nguyên sau khi ủ ở bƣớc 2, 3 lần bằng máy rửa tự động ELISA với mỗi lần 300µl dung dịch đệm.
Bƣớc 5: Quá trình rửa hoàn tất khi dùng khăn giấy lau nhẹ để loại bỏ hoàn toàn bộ đệm còn sót lại.
Bƣớc 6: Thêm 100µl HRPO anti-swine igg vào từng giếng và ủ ấm trong vòng 30 phút.
Bƣớc 7: Rửa tấm kháng nguyên ở bƣớc 6 nhƣ rửa ở bƣớc 4 và bƣớc 5.
Bƣớc 8: Thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng nếu phản ứng dƣơng tính tấm phủ kháng nguyên sẽ nổi rõ màu xanh lá cây.
Bƣớc 9: Thêm vào 50µl TMP để dừng phản ứng. Màu sắc sẽ thay đổi sang màu vàng.
Bƣớc 10: Đọc kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) bằng máy đọc ELiSA ở bƣớc sóng 450nm.
Đánh giá:
Khi giá trị OD của đối chứng (+) (PC) ≥ 0,5 và giá trị OD của đối chứng (-) (NC) ≤0,3 thì đạt yêu cầu đọc kết quả với các tiêu chí đánh giá nhƣ sau:
+ Nếu S/P ≥ 0.4 dƣơng tính (0,4 ≤ S/P < 0,8 (+); 0,8 ≤ S/P < 1,5 (++); 1,5 ≤ S/P (+++))
+ Nếu 0,3 ≤ S/P ≤ 0,4 nghi ngờ + Nếu S/P ≤ 0,3 âm tính.
3.5.3. Phƣơng pháp quan sát, mô tả
Theo dõi hàng ngày: Đo thân nhiệt 2 lần trên ngày lúc 9h và 17h, quan sát và ghi chép các biểu hiện lâm sàng: Thể trạng sức khỏe; tình trạng lông, da; ăn uống; vận động.
3.5.4. Phƣơng pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể
Mổ khám nhằm xác định đƣợc các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh đƣợc cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể nhƣ nhử mắt, nƣớc mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ cơ thể nếu có. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ
quan nhƣ: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận theo các mục đích nghiên cứu khác nhau.
3.5.5. Phƣơng pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phƣơng pháp của Bộ môn Bệnh lý thú y, trƣờng Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. Các bƣớc của quá trình làm tiêu bản vi thể nhƣ sau:
Cố định bệnh phẩm:
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lƣợt các bƣớc sau:
- Rửa formol: Rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ trong 24h. - Đƣa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động bao gồm 12 bình
Bình Hoá chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600 C 1:00 2 Cồn 600 C 1:00 3 Cồn 700 C 1:30 4 Cồn 800 C 1:30 5 Cồn 960 C 1:30 6 Cồn 1000 C 1:30 7 Cồn 1000 C 1:30 8 Cồn 1000 C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 Đúc block
Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin
Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom
Tãi mảnh: Tãi lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nƣớc ấm 480C. Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm đƣợc.
Nhuộm tiêu bản
Các bƣớc tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 6h
Xylen II : 6h Xylen III : 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dƣới vòi nƣớc chảy 15 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nƣớc. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào) Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 – 10 phút, rửa nƣớc. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000
mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.
3.5.6. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC)
Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm đúc bằng parafin giống phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể.
Các bƣớc nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dƣới vòi nƣớc rửa lại tiêu bản bằng nƣớc cất.
Bước 2: Hoạt hóa enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ƣớt ở 1210
C/5 phút.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30% : 9 Methanol. Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể (KT) Nhỏ 80l KT PRRS/tiêu bản
Để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua đêm
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/tiêu bản Để tủ ấm 370C/1h
Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 – 8 phút
Kiểm tra dƣới kính hiển vi thƣờng: nếu nhìn thấy màu thì rửa tiêu bản qua nƣớc; nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB đến khi nhìn thấy màu.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30s), làm sạch, gắn Baume canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kính hiển vi quang học.
3.6. PHƢƠNG PHÁP THỐNG KÊ, XỬ LÝ SỐ LIỆU
Thống kê triệu chứng, nhiệt độ, số lƣợng bạch cầu, số lƣợng kháng thể… sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ biểu diễn tiến triển của bệnh, nhiệt độ, số lƣợng bạch cầu, số lƣợng kháng thể …bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010, MINITAB 16.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG VIRUS CHỦNG PRRSV – CG – 03 – CG – 03
4.1.1. Kết quả xét nghiệm của lợn trƣớc khi gây nhiễm PRRSV – CG - 03
Trƣớc khi gây bệnh thực nghiệm, lợn đƣợc theo dõi trong vòng 7 ngày thấy lợn khỏe mạnh, ăn uống bình thƣờng, không sốt, không có ỉa chảy, không có biểu hiện bất thƣờng. Chúng tôi tiến hành lấy máu của 10 lợn thí nghiệm, chắt huyết thanh kiểm tra hàm lƣợng kháng thể kháng PRRSV bằng phƣơng pháp ELISA. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV bằng phƣơng pháp ELISA (Giá trị S/P )
Ngày Lợn thí nghiệm Lợn đối chứng 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 0,11 0,13 0,19 0,12 0,15 0,11 0,16 0,14 0,12 0,15 2 0,14 0,11 0,16 0,11 0,17 0,17 0,14 0,16 0,12 0,28 3 0,13 0,12 0,1 0,1 0,11 0,14 0,16 0,14 0,13 0,16 4 0,12 0,14 0,15 0,13 0,11 0,12 0,12 0,1 0,1 0,11 5 0,12 0,13 0,1 0,14 0,11 0,12 0,12 0,12 0,14 0,1 6 0,13 0,13 0,1 0,12 0,12 0,15 0,14 0,13 0,15 0,13 7 0,15 0,13 0,12 0,13 0,12 0,12 0,14 0,11 0,15 0,13
Ghi chú: : S/P < 0,3 Âm tính; 0,3<S/P<0,4 Nghi ngờ.
Nhìn vào bảng 4.1, kết quả xét nghiệm huyết thanh bằng phƣơng pháp ELISA ta thấy cả 10 lợn đƣợc lựa chọn cho thí nghiệm đều có giá trị S/P<0,3 điều đó chứng tỏ không có kháng thể kháng PRRSV trong máu, tức là không có khả năng bảo hộ cho lợn khi bị PRRSV tấn công.
Đồng thời chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phƣơng pháp RT – PCR. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phƣơng pháp RT – PCR
Virus Lợn thí nghiệm Lợn đối chứng
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 PRRSV - - - -
PCV2 - - - - FMDV - - - - CSFV - - - - - - - -
Ghi chú: + Dương tính; - Âm tính
PRRSV : Virus gây ra Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PCV2 : Porcine Circovirus Type 2
FMDV : Virus lở mồm long móng CSFV : Virus dịch tả lợn
Theo bảng 4.2, chúng tôi thấy toàn bộ 10 lợn thí nghiệm đều cho kết quả âm tính với virus PRRS, PCV2, FMDV, CSFV. Nhƣ vậy, cả 10 lợn đều đạt yêu cầu thí nghiệm. Trƣớc khi gây bệnh chúng tôi tiến hành theo dõi và đo thân nhiệt của 10 lợn thí nghiệm.
Bảng 4.3 Kết quả đo thân nhiệt trƣớc khi gây nhiễm virus chủng PRRSV- CG - 03
(Đơn vị 0C )
Ngày Lô thí nghiệm Lô đối chứng
1 2 3 4 5 x 1 2 3 4 5 x 1 38,4 38,2 38,4 38,2 38,3 38,3 38,2 38,2 38,0 38,0 38,1 38,1 2 38,3 38,3 38,4 38,2 38,4 38,3 38,5 38,2 38,3 38,5 38,5 38,4 3 38,2 38,2 38,0 38,0 38,1 38,1 38,4 38,6 38.4 38,3 38,6 38,5 4 38,2 38,4 38,5 38,3 38,1 38,3 38,2 38,2 38,0 38,0 38,1 38,1 5 38,2 38,3 38,0 38,4 38,1 38,2 38,2 38,2 38,2 38,4 38,0 38,2 6 38,3 38,3 38,0 38,2 38,2 38,2 38,5 38,4 38,3 38,5 38,3 38,4 7 38,5 38,3 38,2 38,3 38,2 38,3 38,2 38,4 38,1 38,5 38,3 38,3 Nhận xét:
Theo bảng số liệu trên ta có một số nhận xét sau:
+ 10 lợn đƣợc theo dõi 7 ngày trƣớc khi gây nhiễm đều có nhiệt độ trung bình ổn định, phù hợp với nhiệt độ sinh lý bình thƣờng của lợn.
+ Cả 10 lợn đều đạt yêu cầu thí nghiệm và chúng tôi tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho lợn.
4.1.2. Kết quả gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus PRRSV – CG - 03
Hình 4.1. Nhỏ PRRSV – CG - 03 Hình 4.2. Lấy mẫu máu xét nghiệm
Sau khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn bằng virus chủng PRRS – CG – 03. chúng tôi tiến hành lấy máu, dịch swab, phân kiểm tra vào ngày thứ 3, 5, 7, 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 28 sau khi gây nhiễm. Sau đó, chúng tôi làm xét nghiệm các mẫu trên bằng phƣơng pháp RT – PCR để phát hiện sự có mặt của virus. Kết quả đƣợc thấy ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS bằng phƣơng pháp RT – PCR
Ngày sau gây nhiễm
Số mẫu dƣơng tính/ Số mẫu kiểm tra Lợn thí nghiệm Lợn đối chứng
Máu Dịch swab Phân Máu Dịch swab Phân
3 4/5 5/5 1/5 0/5 0/5 0/5 5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 7 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 9 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 11 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 13 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 15 4/4 4/4 4/4 0/5 0/5 0/5 17 4/4 4/4 4/4 0/5 0/5 0/5 19 3/3 3/3 3/3 0/5 0/5 0/5 21 3/3 3/3 3/3 0/5 0/5 0/5 28 3/3 2/3 1/3 0/5 0/5 0/5
Nhận xét: Kết quả bảng 4.4 cho thấy:
+ Ở ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm, cả 5 lợn TN (1, 2, 3, 4 và 5) đều cho kết quả dƣơng tính (+) với virus PRRS dịch swab (dịch mắt, dịch mũi), máu và phân âm tính (-). Phải đến ngày thứ 5 và ngày thứ 7 thì cả 5 lợn thí nghiệm đều cho kết quả (+) với virus PRRS ở cả trong máu, dịch swab (nhử mắt, nhử mũi) và phân.
+ Lợn đối chứng ở tất cả các lần lấy mấu đều cho kết quả âm tính (-). Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã gây nhiễm thành công chủng PRRSV – CG - 03.
4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN BỆNH LỢN BỆNH
4.2.1. Thân nhiệt của lợn sau gây nhiễm virus chủng PRRSV - CG - 03
Trong thí nghiệm, hàng ngày chúng tôi tiến hành đo thân nhiệt 2 lần/ngày của lợn. Vì kiểm tra thân nhiệt là một trong những khâu quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng. Căn cứ vào nhiệt độ của cơ thể có thể thấy phần nào mức độ ảnh hƣởng của bệnh với cơ thể lợn và phản ứng đáp ứng của lợn với bệnh đó.
Bảng 4.5. Diễn biến thân nhiệt của lợn thí nghiệm PRRSV – CG - 03
( Đơn vị 0 C) Ngày Lợn thí nghiệm Lợn đối chứng 1 2 3 4 5 x 1 2 3 4 5 x 1 38,2 38,3 38,0 38,4 38,1 38,2 38,2 38,4 38,5 38,3 38,1 38,3 2 38,5 38,3 38,2 38,3 38,2 38,3 38,5 38,2 38,3 38,5 38,5 38,4 3 39,5 39,4 39,1 38,5 38,0 38,9 38,3 38,3 38,0 38,2 38,2 38,2 4 39,7 39,5 39,5 38,4 38,4 39,1 38,4 38,2 38,4 38,2 38,3 38,3 5 40,7 39,8 39,6 39,8 39,6 39,9 38,2 38,2 38,2 38,4 38,0 38,2 6 40,5 40,3 40,2 40,4 40,1 40,3 38,3 38,3 38,4 38,2 38,4 38,3 7 41,5 40,4 40,8 41,4 40,9 41,0 38,2 38,4 38,1 38,5 38,3 38,3 8 41,5 41,2 40,7 41,8 40,3 41,1 38,2 38,2 38,0 38,0 38,1 38,1 9 41,4 40,9 41,2 41,5 40,5 41,1 38,3 38,5 38,4 38,0 38,3 38,3 10 41,8 40,3 40,2 41,5 41,2 41,0 38,1 38,3 38,3 38,1 38,2 38,2 11 39,8 40,2 40,2 40,8 40,5 40,3 38,5 38,4 38,5 38,2 38,4 38,4 12 37,0 40,0 39,8 40,3 40,3 40,1 38,3 38,2 38,3 38,4 38,3 38,3 13 - 40,5 39,9 41,2 41,0 40,4 38,2 38,3 38,1 38,1 38,3 38,2 14 - 41,2 - 41,5 41,2 41,3 38,4 38,2 38,4 38,3 38,2 38,3 15 - 41,0 - 41,2 41,4 41,2 38,0 38,3 38,2 38,4 38,1 38,2 16 - 41,0 - 41,3 41,0 41,1 38,5 38,0 38,4 38,3 38,3 38,3 17 - 40,8 - 40,8 40,5 40,7 38,2 38,0 38,3 38,2 38,3 38,2 18 - 40,2 - 40,0 40,1 40,1 38,3 38,5 38,4 38,0 38,3 38,3 19 - 39,0 - 39,7 39,8 39,5 38,4 38,6 38,4 38,3 38,6 38,5 20 - 38,5 - 39,0 39,4 38,9 38,5 38,4 38,3 38,5 38,3 38,4 21 - 38,5 - 38,5 39,1 38,7 38,3 38,5 38,1 38,3 38,4 38,3 Ghi chú: - Lợn chết không theo dõi được nhiệt độ nữa
Sốt là trạng thái cơ thể chủ động tăng thân nhiệt do trung tâm điều hòa nhiệt bị tác động bởi các nhân tố gọi là chất gây sốt, dẫn đến tăng sản nhiệt kết hợp với giảm thải nhiệt. Sau 3 ngày gây bệnh thực nghiệm, lợn có biểu hiện đầu tiên là sốt,