Một trong những hướng tiếp cận là làm giàu protein của bột sắn với protein của vi sinh vật. Quá trình làm giàu protein qua con đường lên men với các chủng vi sinh vật được chọn lọc đã được các nghiên cứu chứng minh là rẻ tiền nhất và giá trị protein của sắn được cải thiện hiệu quả nhất (Balagopalan và cộng sự., 1990).
Gray and Abou-El-Seoud (1966) đã sử dụng chủng nấm sợi Cladosporium eladosporoides để lên men sắn lát có bổ sung NH4Cl và dịch chiết của ngô. Kết quả đã thu được sản phẩm lên men có hàm lượng protein thô từ 13-24% VCK. Tương tự, các tác giả Reade and Gregory (1975); Gregory et al. (1977) đã báo cáo ưu điểm của việc sử dụng các chủng nấm sợi chịu nhiệt cho việc làm giàu protein của sắn để sử dụng trong chăn nuôi. Sau khi chọn lọc, các tác giả đã chọn được 3 chủng cho hệ số chuyển hóa protein >2,3. Tuy nhiên, các thí nghiệm này không được khuyến cáo sử dụng trong thực tiễn sản xuất do vấn đề ảnh hưởng của độc tố của nấm đối với sức khỏe của vật nuôi.
Muindi and Hanssen (1981) đã sử dụng chủng nấm Trichoderma
harzianum để lên men bột sắn trên môi trường có bổ sung 4% N vô cơ và ở 23oC,
pH từ 4,0-4,2. Kết quả chuyển hóa sinh khối sau lên men với hàm lượng protein đã tăng từ 2,4% lên đến 37,6% sau 60 giờ lên men. Hàm lượng N phi protein chiếm khoảng 30% N tổng số. Tuy nhiên, năng lượng trao đổi ME của bột sắn lên men làm giàu protein lại thấp hơn rõ rệt với p<0,05 so với bột sắn không lên men (9,1MJ/kg so với 12,2 MJ/kg VCK).
Maurince Raimbault et al. (1985) cho biết, sau 25-48 giờ lên men hàm lượng protein của bột sắn sau khi lên men với 18 chủng nấm sợi được phân lập và chọn lọc từ các thực phẩm lên men truyền thống đã tăng từ 10,9-16,5% so với trước khi lên men. Trong đó các chủng thuộc giống Aspergillus sp. có hiệu suất chuyển hóa protein cao nhất.
Okpako et al. (2008) đã báo cáo rằng, hàm lượng protein thô của vỏ sắn đã tăng từ 5,50 lên 24,4% khi lên men với một hỗn hợp gồm nấm mốc
Aspergillus niger và vi khuẩn lactic Lactobacillus rhamnosus. Ezekiel và công sự (2010) cũng thông báo kết quả tương tự khi sử dụng nấm Trichoderma viride ATCC 36316 lên men vỏ sắn. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein thô của vỏ sắn lên men đã tăng từ 4,21 lên 36,52% và hàm lượng tinh bột giảm từ 51,93 xuống 26,07% sau 4 ngày lên men.
Ngoài nấm sợi, nấm men cũng được chọn lựa để sử dụng lên men làm giàu các phụ phẩm của ngành chế biến tinh bột sắn do hàm lượng protein của nấm men cao và không sản sinh độc tố. Bên cạnh đó, nấm men còn giàu vitamin, đặc biệt là thiamin, giúp kích thích tăng trưởng nhóm nấm trong dạ cỏ (Chaucheyras và công sự., 1995).
Shrassen et al. (1970) đã báo cáo, sử dụng nấm men Candida utilis để lên men bột sắn đã được thủy phân với enzyme với kỹ thuật lên men bề mặt đã thu được sinh khối sau lên men có hàm lượng protein đạt 35% VCK.
Azoulay và cs (1980) cho biết, sử dụng nấm men như Candida tropicalis để lên men bột sắn đã làm tăng hàm lượng protein từ 3,1% lên 18,8% VCK mà không cần phải bổ sung thêm các enzyme thủy phân tinh bột.
Oboh (2006) đã tiến hành thí nghiệm làm giàu vỏ sắn với hỗn hợp vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men rắn. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein của vỏ sắn lên men đã tăng 21,5% so với 8,2% của lô không lên men. Đồng thời hàm lượng Cyanide của vỏ sắn lên men cũng giảm rõ rệt so với lô không lên men (6,2mg/kg so với 44,6mg/kg).
Tác giả khuyến cáo, vỏ sắn sau lên men không còn độc tố và dễ tiêu hóa, có thể sử dụng bổ sung trong khẩu phần ăn cho vật nuôi.
Tương tự, một số tác giả đã báo cáo kết quả sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisae lên men làm giàu protein của bã sắn để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi ( Srinorakutara et al., 2006; Ubalua, 2007).
Một nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của củ sắn nhờ vi sinh vật được nhắc đến như Boonnopetal và cộng sự (2009) và Polyorachetal và cộng sự (2010) đã sử dụng chế phẩm nấm men (Saccharomyces cerevisiae) để lên men lát sắn khô và kết quả thu được đã nâng cao được protein thô từ 3,4 đến 32,5 % trong sắn lên men. Sử dụng sắn lên men này cho bò sữa kết quả thu được là làm tăng sản lượng sữa.
Kaewwongsa et al. (2011) đã tiến hành lên men làm giàu protein của bã sắn với 5% nấm men S. cerevisiae có bổ sung thêm 1,25% rỉ mật đường và 10% ure. Hàm lượng protein thô và protein thuần của sinh khối đạt 26,4 và 24,7% sau 5 ngày lên men. Các tác giả cũng tiến hành đánh giá khả năng tiêu hóa in vivo của bã sắn lên men trên dê thịt 8-10 tháng tuổi. Kết quả cho thấy, bã sẵn lên men đã cải thiện đáng kể hàm lượng protein phân giải trong dạ có (Ruminal undegradable protein).
Polyorach et al. (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các mức bổ sung ure, rỉ đường đến sinh trưởng của nấm men S. cerevisiae trong quá trình lên men làm giàu protein của sắn lát. Các tác giả đã cho biết, sắn lát lên men với nấm men trên môi trường có bổ sung ure, rỉ mật đường với tỷ lệ lần lượt là 64:08 g/100 ml nước có hàm lượng protein thô đạt cao nhất 47,5% sau 66 giờ lên men. Sản phẩm lên men được sử dụng thay thế bột đậu tương trong thử nghiệm chăn nuôi gia súc nhai lại.
Gần đây, Gunawan et al. (2015) đã tiến hành so sánh hiệu quả lên men làm giàu protein của sắn của vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum,
Saccharomyces cerevisieae và Rhizopus oryzae. Kết quả cho thấy, với tỷ lệ bổ
sung là 1% để lên men sắn lát trong 120 giờ, hàm lượng protein thô của sắn đã tăng cao nhất khi lên men với vi khuẩn lactic từ 1,92% lên 8,58% so với 2,29% với nấm men và 4,72% với nấm mốc. Tương tự hàm lượng cyanide giảm mạnh nhất khi lên men với L. plantarum, giảm từ 17,5 xuống 1,8mg/kg.
Một số tác giả như Adeyemi et al. (2007); Ezeronye (2004) và Chumpawadee (2009) đã sử dụng dịch dạ cỏ để lên men bã sắn, vỏ sắn nhằm cải thiện hàm lượng protein của các phụ phẩm này. Các tác giả cho biết, hàm lượng protein thô của bã sắn tăng từ 2,52 lên 17,58%; của vỏ sắn tăng từ 2,49 lên 19,24% sau 4 ngày lên men yếm khí. Hệ vi sinh vật dạ cỏ như nấm, vi khuẩn và protozoa có khả năng phân giải tốt chất xơ trong vỏ và bã sắn để chuyển hóa thành protein của vi sinh vật.
Như vậy có thể thấy hướng sử dụng vi sinh vật để lên men nhằm nâng cao hàm lượng protein của các phụ phẩm chế biến tinh bột sắn là một hướng đi đúng và hoàn toàn khả thi không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới, nhất là những nước đang sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp trong chăn nuôi để giảm chi phí thức ăn như Việt Nam.
PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG – ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Giống nấm men Saccharomyces cerevisiae được phân lập, chọn lọc từ các mẫu bánh men rượu và lưu giữ giống tại bộ môn Dinh dưỡng – Thức ăn, Khoa Chăn nuôi gồm 05 chủng ký hiệu là SAC1, SAC2, SAC3, SAC4 và SAC5.
Bột sắn (loại bột thương mại) và bã sắn khô được thu mua từ huyện Hoài Đức, Hà Nội.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng vi sinh vật bộ môn Dinh dưỡng –Thức ăn, khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian: Từ tháng 1/2017 đến tháng 7/2017.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
3.2.1. Xác định thành phần hoá học của bột và bã sắn trước khi lên men Hàm lượng VCK, protein thô, protein thuần, N phi protein. Hàm lượng VCK, protein thô, protein thuần, N phi protein.
3.2.2. Xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp của các chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae
Xác định tốc độ sinh trưởng của tế báo nấm men.
Đánh giá khả năng tích lũy sinh khối của tế báo nấm men.
3.2.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng protein của bột và bã sắn
Đánh giá chất lượng bột, bã sắn lên men: đánh giá cảm quan, sự biến đổi pH trong quá trình lên men.
Đánh giá sự biến đổi số lượng tế bào nấm men trong quá trình lên men.
Đánh giá sự biến đổi hàm lượng protein trong quá trình lên men.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
a. Chuẩn bị giống nấm men
Giống trước khi sử dụng trong thí nghiệm cần được kiểm tra độ thuần khiết. Giống đạt yêu cầu sẽ được nhân giống ra môi trường Hansen dịch thể và
nuôi cấy trong 24-48h. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, số lượng tế bào phải đảm bảo đạt tối thiểu ≥108 . Tiếp tục nhân giống cấp 2 trên môi trường lên men bề mặt trong thời gian từ 48-72h.
b. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nhân giống: Môi trường Hansen :
Glucose: 50g Peptone: 10g
KH2PO4: 3g MgSO4: 3 - 5g
Thạch Agar: 16 - 20g Nước cất: 1000ml
Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 – 20 phút.
Điều chỉnh pH = 5 – 5,5 bằng axit H2SO4 và NaOH 1N sau đó hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 – 20 phút. Môi trường nhân giống dịch thể không sử dụng thạch. Môi trường lên men:Sử dụng 03 công thức có bổ sung các mức urê khác nhau. Các mức ure bổ sung được tính dựa trên hàm lượng N (%) có trong urê, với 3 mức 5g N, 7g N và 10g N. Công thức 3 môi trường được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các mức bổ sung Ure trong thí nghiệm
Thành phần CT1 CT2 CT3 Glucose 50g/l 50g/l 50g/l Urê 21.7g/l (Tương ứng với 10g N) 32.6g/l (Tương ứng với 15g N) 43.5g/l (Tương ứng với 20g N) KH2PO4 3g/l 3g/l 3g/l MgSO4.7H20 5g/l 5g/l 5g/l Nước: 1000ml. Điều chỉnh pH từ 5,0-5,5
Do Urê dễ bay hơi làm thất thoát N nên sau khi môi trường được hấp tiệt trùng, để nguội mới bổ sung Urê vào khuấy cho tan. Chỉ chuẩn bị môi trường trước khi lên men.
3.3.2. Phương pháp phân tích thành phần hóa học của bột và bã sắn
Các chỉ tiêu phân tích được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Công ty Cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Hải Dương.
Bột và bã sắn trước khi lên men được lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 để phân tích thành phần hóa học gồm các chỉ tiêu vật chất khô, hàm lượng protein thô, hàm lượng protein thuần, nitơ phi protein, hàm lượng xơ thô.
3.3.3. Đánh giá tỷ lệ tiếp giống thích hợp của các chủng nấm men
Nuôi cấy 5 chủng giống nấm men SAC1, SAC2, SAC3, SAC4 và SAC5 vào môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ tiếp giống sử dụng là 1%, 3% và 5%. Tiến hành nuôi cấy ở 30oC/48h.
Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer.
a. Đánh giá sinh trưởng và tích lũy sinh khối của các chủng giống
Nuôi cấy các chủng nấm men trên môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ tiếp giống 5% và số lượng TB đạt khoảng 1x106TB/ml. Các chủng được nuôi cấy ở 30oC/24-48h. Đếm số lượng tế bào để đánh giá tốc độ sinh trưởng của các chủng kiểm tra bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi với buồng đếm hồng cầu Neubauer. Lựa chọn chủng có tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng tạo sinh khối lớn nhất.
Tiến hành: số lượng tế bào nấm men được đếm ở các thời điểm 0, 1, 3, 5, 7 ngày sau khi ủ. Cách lấy mẫu, lấy 10g mẫu ở nhiều vị trị khác nhau trong thùng ủ. Sau đó trộn đều các mẫu với nhau và pha loãng với nước cất rồi lọc lấy dung dịch.
Chỉ tiêu theo dõi gồm: * Xác định số lượng tế bào
Số lượng TB được đếm tại thời điểm 48h nuôi cấy bằng buồng đếm hồng cầu.
Pha loãng mẫu, sao cho mật độ tế bào nằm trong khoảng 250.000 TB/ml – 2,5 triệu TB/ml. Tốt nhất nên nằm ở khoảng 1 triệu tế bào/ml. Nếu mật độ tế bào <250000TB/ml thì số lượng tế bào không đủ để xác định chính xác số lượng tế bào có trong dung dịch mẫu. Trong trường hợp mật độ tế bào khi pha loãng >2,5 triệu TB/ml thì sẽ làm tăng sai sót trong quá trình đếm do mật độ quá dày.
Nhỏ 10µl dung dịch mẫu lên buồng đếm, đậy lamen lên trên sao cho dung dịch được dàn mỏng toàn bộ mặt buồng đếm và không tạo thành bọt khí. Nếu lấy quá nhiều dung dịch mẫu thì sử dụng giấy thấm thấm bớt dung dịch thừa.
Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính có độ phóng đại từ 10 - 40 lần để điều chỉnh đến khi rõ nét. Đếm ô ở giữa buồng đếm. Ô ở giữa có 25 ô vuông nhỏ. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở 5 ô vuông nhỏ (4 ô ở 4 góc và 1 ô vuông ở giữa). Cách đếm: Đếm lần lượt từng ô lớn, bắt đầu từ trái qua phải, từ trên xuống dưới theo hình zig- zac. Các tế bào nằm ở đường viền trên và bên trái thì đếm. Ngược lại, tế bào nằm ở đường viền dưới và bên phải thì không đếm.
Cách tính kết quả: Số lượng tế bào/ml dung dịch mẫu được tính theo công thức sau:
Tổng số TB đếm được ở các ô vuông Số lượng TB/ml =
Số ô vuông x Thể tích ô vuông (ml) x Độ pha loãng Đếm ở ô vuông trung tâm buồng đếm, gồm 25 ô vuông nhỏ. Đếm 5 ô vuông nhỏ. Mỗi ô vuông nhỏ có kích thước 1mm/ 5 = 0,2mm
Thể tích ô vuông nhỏ được tính như sau:
- Diện tích của 1 ô vuông: 0,2 mm x 0,2mm = 0,04mm2
- Chiều sâu của buồng đếm tính từ lamen là 0,1mm hay 0,01cm
- Thể tích của 1 ô vuông = 0,04mm2 x 0,1mm = 0,004mm3 = 4x 10-6 ml
Tốc độ sinh trưởng của TB nấm men được tính theo công thức sau:
(Số lượng TB sau khi nuôi cấy- Số lượng TB ban đầu) TĐST (lần) =
Số lượng TB ban đầu
* Xác định tỷ lệ tế bào nảy chồi
Tỷ lệ tế bào nấm men nảy chồi được tính theo công thức sau: Số lượng TB nảy chồi
Tỷ lệ TB nảy chồi (%) = x 100 Tổng số TB đếm được
* Xác định sinh khối tế bào
Sinh khối tích lũy của các chủng giống nghiên cứu được xác định bằng phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào: Dung dịch nuôi cấy nấm men được thu sau 48h nuôi cấy ở 30oC. Tiến hành lọc qua giấy lọc để loại bỏ phần dung dịch. Đem sấy giấy lọc có chứa mẫu ở 105oC/2h. Sau đó đem cân khối lượng giấy lọc có chứa mẫu.
Sinh khối TB = Pt – Po
Pt: Khối lượng giấy lọc chứa mẫu sau sấy. Po: Khối lượng giấy lọc trước khi lọc.
Từ kết quả thu được sẽ lựa chọn 02 chủng nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất với số lượng TB và khả năng tích lũy sinh khối cao nhất. Ngoài ra, lựa chọn 01 tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.4. Phương pháp lên men làm giàu protein của bột và bã sắn
a. Phương pháp lên men rắn
Bước 1: Chuẩn bị giống nấm men.
Chọn 02 chủng giống có tốc độ sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn ở nội dung 2 sẽ được nuôi cấy nhân giống sản xuất trên môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ 1:1 ở 30oC/48h. Sau đó tiến hành đánh giá chất lượng giống qua các chỉ tiêu:
Kiểm tra tạp nhiễm: sử dụng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000x
Đếm số lượng TB: giống phải có số lượng TB tối thiểu ≥108/ml
Bước 2: Chuẩn bị nguyên liệu và môi trường lên men
Bột sắn: sử dụng loại bột Sắn thương mại.
Bã sắn được sấy khô ở 60oC/48h, sau đó được nghiền nhỏ (1-2mm).
Môi trường: chuẩn bị môi trường lên men rắn.
Chuẩn bị thùng ủ: Mỗi thùng ủ 3kg, có nắp đậy.