Phương pháp nghiên cứu - (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên- 123docz.net

3.3.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu

a. Chuẩn bị giống nấm men

Giống trước khi sử dụng trong thí nghiệm cần được kiểm tra độ thuần khiết. Giống đạt yêu cầu sẽ được nhân giống ra môi trường Hansen dịch thể và

nuôi cấy trong 24-48h. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, số lượng tế bào phải đảm bảo đạt tối thiểu ≥108 . Tiếp tục nhân giống cấp 2 trên môi trường lên men bề mặt trong thời gian từ 48-72h.

b. Môi trường nuôi cấy

Môi trường nhân giống: Môi trường Hansen :

Glucose: 50g Peptone: 10g

KH2PO4: 3g MgSO4: 3 - 5g

Thạch Agar: 16 - 20g Nước cất: 1000ml

Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 – 20 phút.

Điều chỉnh pH = 5 – 5,5 bằng axit H2SO4 và NaOH 1N sau đó hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 – 20 phút. Môi trường nhân giống dịch thể không sử dụng thạch. Môi trường lên men:Sử dụng 03 công thức có bổ sung các mức urê khác nhau. Các mức ure bổ sung được tính dựa trên hàm lượng N (%) có trong urê, với 3 mức 5g N, 7g N và 10g N. Công thức 3 môi trường được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Các mức bổ sung Ure trong thí nghiệm

Thành phần CT1 CT2 CT3 Glucose 50g/l 50g/l 50g/l Urê 21.7g/l (Tương ứng với 10g N) 32.6g/l (Tương ứng với 15g N) 43.5g/l (Tương ứng với 20g N) KH2PO4 3g/l 3g/l 3g/l MgSO4.7H20 5g/l 5g/l 5g/l Nước: 1000ml. Điều chỉnh pH từ 5,0-5,5

Do Urê dễ bay hơi làm thất thoát N nên sau khi môi trường được hấp tiệt trùng, để nguội mới bổ sung Urê vào khuấy cho tan. Chỉ chuẩn bị môi trường trước khi lên men.

3.3.2. Phương pháp phân tích thành phần hóa học của bột và bã sắn

Các chỉ tiêu phân tích được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Công ty Cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Hải Dương.

Bột và bã sắn trước khi lên men được lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 để phân tích thành phần hóa học gồm các chỉ tiêu vật chất khô, hàm lượng protein thô, hàm lượng protein thuần, nitơ phi protein, hàm lượng xơ thô.

3.3.3. Đánh giá tỷ lệ tiếp giống thích hợp của các chủng nấm men

Nuôi cấy 5 chủng giống nấm men SAC1, SAC2, SAC3, SAC4 và SAC5 vào môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ tiếp giống sử dụng là 1%, 3% và 5%. Tiến hành nuôi cấy ở 30oC/48h.

Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer.

a. Đánh giá sinh trưởng và tích lũy sinh khối của các chủng giống

Nuôi cấy các chủng nấm men trên môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ tiếp giống 5% và số lượng TB đạt khoảng 1x106TB/ml. Các chủng được nuôi cấy ở 30oC/24-48h. Đếm số lượng tế bào để đánh giá tốc độ sinh trưởng của các chủng kiểm tra bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi với buồng đếm hồng cầu Neubauer. Lựa chọn chủng có tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng tạo sinh khối lớn nhất.

Tiến hành: số lượng tế bào nấm men được đếm ở các thời điểm 0, 1, 3, 5, 7 ngày sau khi ủ. Cách lấy mẫu, lấy 10g mẫu ở nhiều vị trị khác nhau trong thùng ủ. Sau đó trộn đều các mẫu với nhau và pha loãng với nước cất rồi lọc lấy dung dịch.

Chỉ tiêu theo dõi gồm: * Xác định số lượng tế bào

Số lượng TB được đếm tại thời điểm 48h nuôi cấy bằng buồng đếm hồng cầu.

Pha loãng mẫu, sao cho mật độ tế bào nằm trong khoảng 250.000 TB/ml – 2,5 triệu TB/ml. Tốt nhất nên nằm ở khoảng 1 triệu tế bào/ml. Nếu mật độ tế bào <250000TB/ml thì số lượng tế bào không đủ để xác định chính xác số lượng tế bào có trong dung dịch mẫu. Trong trường hợp mật độ tế bào khi pha loãng >2,5 triệu TB/ml thì sẽ làm tăng sai sót trong quá trình đếm do mật độ quá dày.

Nhỏ 10µl dung dịch mẫu lên buồng đếm, đậy lamen lên trên sao cho dung dịch được dàn mỏng toàn bộ mặt buồng đếm và không tạo thành bọt khí. Nếu lấy quá nhiều dung dịch mẫu thì sử dụng giấy thấm thấm bớt dung dịch thừa.

Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính có độ phóng đại từ 10 - 40 lần để điều chỉnh đến khi rõ nét. Đếm ô ở giữa buồng đếm. Ô ở giữa có 25 ô vuông nhỏ. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở 5 ô vuông nhỏ (4 ô ở 4 góc và 1 ô vuông ở giữa). Cách đếm: Đếm lần lượt từng ô lớn, bắt đầu từ trái qua phải, từ trên xuống dưới theo hình zig- zac. Các tế bào nằm ở đường viền trên và bên trái thì đếm. Ngược lại, tế bào nằm ở đường viền dưới và bên phải thì không đếm.

Cách tính kết quả: Số lượng tế bào/ml dung dịch mẫu được tính theo công thức sau:

Tổng số TB đếm được ở các ô vuông Số lượng TB/ml =

Số ô vuông x Thể tích ô vuông (ml) x Độ pha loãng Đếm ở ô vuông trung tâm buồng đếm, gồm 25 ô vuông nhỏ. Đếm 5 ô vuông nhỏ. Mỗi ô vuông nhỏ có kích thước 1mm/ 5 = 0,2mm

Thể tích ô vuông nhỏ được tính như sau:

- Diện tích của 1 ô vuông: 0,2 mm x 0,2mm = 0,04mm2

- Chiều sâu của buồng đếm tính từ lamen là 0,1mm hay 0,01cm

- Thể tích của 1 ô vuông = 0,04mm2 x 0,1mm = 0,004mm3 = 4x 10-6 ml

Tốc độ sinh trưởng của TB nấm men được tính theo công thức sau:

(Số lượng TB sau khi nuôi cấy- Số lượng TB ban đầu) TĐST (lần) =

Số lượng TB ban đầu

* Xác định tỷ lệ tế bào nảy chồi

Tỷ lệ tế bào nấm men nảy chồi được tính theo công thức sau: Số lượng TB nảy chồi

Tỷ lệ TB nảy chồi (%) = x 100 Tổng số TB đếm được

* Xác định sinh khối tế bào

Sinh khối tích lũy của các chủng giống nghiên cứu được xác định bằng phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào: Dung dịch nuôi cấy nấm men được thu sau 48h nuôi cấy ở 30oC. Tiến hành lọc qua giấy lọc để loại bỏ phần dung dịch. Đem sấy giấy lọc có chứa mẫu ở 105oC/2h. Sau đó đem cân khối lượng giấy lọc có chứa mẫu.

Sinh khối TB = Pt – Po

Pt: Khối lượng giấy lọc chứa mẫu sau sấy. Po: Khối lượng giấy lọc trước khi lọc.

Từ kết quả thu được sẽ lựa chọn 02 chủng nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất với số lượng TB và khả năng tích lũy sinh khối cao nhất. Ngoài ra, lựa chọn 01 tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho nghiên cứu tiếp theo.

3.3.4. Phương pháp lên men làm giàu protein của bột và bã sắn

a. Phương pháp lên men rắn

Bước 1: Chuẩn bị giống nấm men.

Chọn 02 chủng giống có tốc độ sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn ở nội dung 2 sẽ được nuôi cấy nhân giống sản xuất trên môi trường Hansen dịch thể với tỷ lệ 1:1 ở 30oC/48h. Sau đó tiến hành đánh giá chất lượng giống qua các chỉ tiêu:

Kiểm tra tạp nhiễm: sử dụng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000x

Đếm số lượng TB: giống phải có số lượng TB tối thiểu ≥108/ml

Bước 2: Chuẩn bị nguyên liệu và môi trường lên men

 Bột sắn: sử dụng loại bột Sắn thương mại.

 Bã sắn được sấy khô ở 60oC/48h, sau đó được nghiền nhỏ (1-2mm).

 Môi trường: chuẩn bị môi trường lên men rắn.

 Chuẩn bị thùng ủ: Mỗi thùng ủ 3kg, có nắp đậy.

Môi trường lên men bề mặt và nguyên liệu (cơ chất) để lên men được chuẩn bị như ở mục 2.3.3

Môi trường được khử trùng ở 121oC/1atm/15 phút. Sau đó được chia vào thùng ủ, mỗi thùng có khối lượng 3kg. Mỗi một công thức ủ 9 thùng.

Bước 3:Lên men

Tiếp giống với tỷ lệ được lựa chọn ở nội dung 2. Dung dịch nuôi cấy giống được trộn đều với nguyên liệu lên men, đảm bảo độ ẩm từ 45-55%. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ phòng với nhiệt độ dao động từ 25-30oC.

Đánh giá kết quả ở các thời điểm: 1, 3, 5 và 7 ngày.

Các chỉ tiêu đánh giá gồm: đánh giá cảm quan, xác định pH, phân tích hàm lượng protein thô, protein thuần, N- phi protein và đếm số lượng TB nấm men.

b. Đánh giá cảm quan

Đánh giá chất lượng lên men thông qua các chỉ tiêu cảm quan như màu sắc, mùi, trạng thái, nhiệt độ, độ mốc hỏng, hơi nước trên nắp thùng.

c. Phương pháp xác định pH

Giá trị pH của thức ăn lên men được xác định theo phương pháp Hristov và Jones (2000) với máy đo pH (máy đo Mettler ToleDo) tại phòng Thí nghiệm trung tâm Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam. Lấy giá trị trung bình của 3 lần đo.

d. Phân tích một số chỉ tiêu thành phần hóa học

Lấy mẫu để phân tích hàm lượng protein ở các thời điểm 0, 1, 3, 5, 7 ngày sau khi ủ theo TCVN 4325:2007(2007).

Hàm lượng VCK được xác định theo TCVN 4326-2001.

Hàm lượng protein thô xác định bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2007. Lượng protein thô = N tổng số (%) × 6,25.

Phân tích hàm lượng protein thuần bằng phương pháp Kjeldahl sử dụng với trichloroacetic acid (CCl3COOH) để tạo kết tủa.

Lượng protein thuần = N thực (%) × 6,25. Phân tích N phi protein:

bằng hiệu số giữa N tổng (%) với N thực (%) × 6,25. e. Đếm số lượng tế bào nấm men

Phương pháp đếm số lượng: sử dụng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi, bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer.

3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Số liệu thô được xử lý với bảng tính Excel (Microsof Excel, 2010) và minitab16.

PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BỘT VÀ BÃ SẮN BỘT VÀ BÃ SẮN

Kết quả phân tích vật chất khô, protein thô, nitơ phi protein, protein thuần của bã sắn và bột sắn khô trước khi ủ được trình bày ở bảng 4.1.

Bảng 4.1 Hàm lương protein của bột sắn và bã sắn trước khi lên men Nguyên liệu VCK (%) Protein thô (%VCK) N- phi protein (% VCK) Protein thuần (%VCK) Xơ thô (% VCK) Bã sắn (n=3) 85,52 ± 0,3 2,58± 0,2 0,35± 0,04 2,23± 0,2 14,06 ± 0,2 Bột sắn (n=3) 90,84 ± 0,2 2,75± 0,1 0,20± 0,02 2,55± 0,1 2,08 ± 0,1

Qua kết quả ở bảng 4.1 chúng tôi có nhận xét:

Hàm lượng vật chất khô của bột và bã sắn khá cao. Ở bột sắn hàm lượng VCK là 90,84; của bã sắn là 85,52. Kết quả phân tích hàm lượng protein thô của bột và bã sắn cho thấy cả hai loại nguyên liệu này đều có hàm lượng protein thô rất thấp. Hàm lượng protein thô ở bã sắn chiếm 2,58%, trong đó N phi protein chiếm 0,35%; Ở bột sắn hàm lượng protein cao hơn, chiếm 2,75% với hàm lượng N phi protein là 0,20%.

Theo Nguyễn Văn Phú và cs. (2015), hàm lượng protein của bã sắn rất thấp chiếm 1,87% VCK. Đặng Thị Thu (1995), bã sắn thu từ nhà máy sản xuất tinh bột có hàm lượng protein rất thấp là 1,50%.

Trong khi đó, Nguyễn Hữu Văn và cs. (2008) cho biết hàm lượng protein thô của bã sắn tươi chỉ chiếm 3,6% VCK nhưng giá trị năng lượng tương đối cao 4198 kcal/kg VCK. Trong thực tế phân tích tại nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi CP Việt nam cho thấy VCK của Bã sắn khoảng 87% và hàm lượng protein thô khoảng 1,50% VCK. Theo các tác giả nếu sử dụng làm thức ăn cho gia súc nhai lại thì cần phải bổ sung thêm nguồn thức ăn giàu protein để cân đối năng lượng và protein trong khẩu phần.

Theo Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1995), Bột sắn nghiền thủ công có vật chất khô khoảng 87,56%, đạm thô 3,52%, dẫn xuất không đạm 83,89%. Nghiên cứu của Uchegbu et al. (2011) cũng cho thấy, hàm lượng VCK ở bột sắn chiếm 87,75% , protein thô chiếm 3,59%.

Theo Đặng Hoàng Lâm (2013) cho biết các giống sắn ở Việt Nam có tỷ lệ protein từ 2,44 đến 4,13%. Các giống sắn có tỷ lệ protein cao thì hàm lượng protein thường từ 3,78 - 4,61%, còn các giống có tỷ lệ protein thấp thì hàm lượng protein chỉ từ 2,4% đến 2,75%.

Ngoài hàm lượng protein thô thấp < 4%, thì bột và bã sắn còn có thể chứa các thành phần gây độc cho vật nuôi như HCN (McDonald et al., 1988; Igwebuike and Okonkwo, 1993).

Như vậy việc lên men bột và bã sắn với vi sinh vật như nấm men Saccharomycesserevisiae và nấm sợi là một trong những biện pháp vừa giúp cải thiện hàm lượng protein và vừa làm giảm hàm lượng HCN trong bột, bã sắn (Araujo et al., 2008; Hong and Ca, 2013).

4.2. ĐÁNH GIÁ TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TIẾP GIỐNG THÍCH HỢP CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN GIỐNG GIỐNG THÍCH HỢP CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN GIỐNG

4.2.1. Đánh giá tôc độ sinh trưởng của các chủng nấm men giống

Từ 05 chủng nấm men được tiến hành nuôi cấy trên môi trường Hansen dịch thể ở 30oC/48h. Kết quả xác định số lượng TB và sinh khối tích lũy của các chủng kiểm tra được trình bày ở bảng 4.2

Bảng 4.2. Tốc độ sinh trưởng và khả năng tích lũy sinh khối của các chủng nấm men giống

GIỐNG

Số lượng tế bào

(triệu TB/ml) số lượng TB Tốc độ tăng (lần) Sinh khối khô (mg/ml) 0h 48h SAC1 1,67 76,25 44,59 0,12 SAC2 1,58 73,25 45,36 0,14 SAC3 1,69 183,17 87,92 0,26 SAC4 1,96 144,75 72,95 0,21 SAC5 1,74 98,75 55,84 0,17

Qua kết quả của bảng 4.2 chúng tôi thấy, trong số 5 chủng giống kiểm tra chỉ có 2 chủng SAC3 và SAC4 có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất với số lượng tế bào thu được cao nhất và lượng tích lũy sinh khối lớn nhất. Cụ thể:

Chủng SAC3, sau 48h nuôi cấy số lượng TB thu được là 183,17 triệu/ml, tăng 87,92 lần so với số lượng TB nuôi cấy ban đầu. Lượng sinh khối tích lũy của chủng này đạt 0,26mg/ml sau 48h nuôi cấy.

Chủng SAC4, số lượng TB thu được là 144,75 triệu/ml, với tốc độ tăng số lượng là 72,97 lần so vơi ban đầu và lượng sinh khối tích lũy được là 0,21mg/ml sau 48h nuôi cấy.

Từ kết quả trên chúng tôi lựa chọn 02 chủng SAC3 và SAC4 để sử dụng lên men bột và bã sắn ở thí nghiệm sau.

4.2.2. Xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp của các chủng nấm men giống

Tỷ lệ bổ sung giống trong quá trình lên men bột và bã sắn được lựa chọn với 3 mức 1%, 3% và 5% thể tích dung dịch nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3.

Từ kết quả thu được chúng tôi có nhận xét:

Sau 48h nuôi cấy số lượng TB thu được lớn nhất với tốc độ tăng trưởng cao nhất ở mức tiếp giống 5% ở hai chủng SAC3 với 136,25 triệu/ml, tăng 165,88% và ở chủng SAC4 với 120,75 triệu TB/ml, tăng 126,92% so với số lượng TB nuôi cấy ban đầu.

Hai chủng SAC3 và SAC4 cũng có số lượng TB nảy chồi cao nhất tương ứng là 69,50 triệu/ml và 53,75 triệu/ml. Tỷ lệ TB nảy chồi ở chủng SAC3 chiếm 51,01% và ở chủng SAC4 chiếm 44,51% số lượng TB nấm men thu được sau 48h nuôi cấy. Số lượng TB nảy chồi lớn cho thấy quần thể nấm men đang trong giai đoạn sinh sản mạnh mẽ. Tế bào thu được gồm nhiều tế bào trẻ và giống sẽ có tốc độ sinh trưởng lớn. Như vậy, có thể thấy hai chủng SAC3 và SAC4 vẫn đang trong giai đoạn sinh trưởng logarit và nếu nuôi cấy kéo dài hơn thì số lương tế bào sẽ tiếp tục tăng.

So sánh tốc độ sinh trưởng của các chủng giống kiểm tra được biểu diễn qua biểu đồ 4.1. Qua biểu đồ, có thể thấy rõ mức bổ sung giống 5% thể tích dịch nuôi cấy cho kết quả tăng số lượng TB lớn nhất sau 48h nuôi cấy ở tất cả các chủng kiểm tra. Số lượng TB cao nhất và đạt >108/ml ở chủng SAC3 và SAC4