PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phân sinh
T.asperellum. b) Tản nấm trên môi trường PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phân sinh T. harzianum. Thanh bar 10µm.
Xuất phát từ sự phổ biến, tốc độ phát triển và hình thành bào tử phân sinh rất nhanh của nấm T. asperellum. Hơn nữa, đã lần đầu xác định sự có mặt của nấm T. asperellum ở đất trồng rau mầu của một số tỉnh miền Bắc. Vì vậy, trong nghiên cứu này đã chọn nấm T. asperellum để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo như đặc điểm sinh học, nhân sinh khối, thử khả năng ức chế đối với một số nấm gây bệnh cũng như thử khả năng phòng trừ một số bệnh hại quan trọng như bệnh lở cổ rễ cây con bắp cải và bệnh thối hạch bắp cải ngoài sản xuất nhằm so sánh với các nguồn nấm Trichoderma sp. trước đây như T. viride, T. harzianum,...
4.2.2. Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma asperellum
4.2.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Vi sinh vật nói chung và nấm đối kháng nói riêng, môi trường dinh dưỡng đóng một vai trò quan trọng trọng sự phát triển và sinh sản (hình thành bào tử phân sinh) của nấm. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma
phát triển thuận lợi trên môi trường PDA và một số môi trường khác như PSA, PCA...Vì vậy, trong nghiên cứu này cũng đã khảo sát sự phát triển của nấm
T. asperellum trên một số môi trường như PDA, PSA và OMA (bảng 4.5).
Bảng 4.5. Khả năng phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Môi trường
Đường kính tản nấm (mm) sau cấy (ngày) Số bào tử /1 ml sau cấy 9 ngày
1 2 3 4 5 6
PDA 19,5a 58,5a 83,3a 90,0a 90,0 90,0 5464 x 105 PSA 19,5a 55,5b 79,4b 85,0b 90,0 90,0 5322 x 105 OMA 13,5b 44,5b 73,0c 84,0b 90,0 90,0 5136 x 105 LSD0,05 1,41 2,81 2,38 1,73 0 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Hình 4.5. Sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Kết quả cho thấy, cũng giống như nhiều nấm gây bệnh và các nấm đối kháng Trichoderma sp. khác, nấm T. asperellum phát triển thuận lợi trên các môi trường PSA, PDA và OMA. Tuy nhiên, nấm phát triển tốt nhất trên môi trường PDA, sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm là 90mm. Khả năng hình thành bào tử phân sinh trên cả 3 môi trường này cũng khá nhanh. Ở môi trường PDA sau 9 ngày nuôi cấy cho số bào tử/1ml cao nhất, đạt 5464 x 105. Như vậy, môi trường PDA sẽ được chọn là môi trường dùng để nhân nguồn nấm từ giống cấp 1 để tạo nguồn ban đầu cho việc nhân sinh khối nấm Trichoderma.
4.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và nấm đối kháng nói riêng. Đa số các vi sinh vật đặc biệt là nấm gây bệnh phát triển và gây hại trong phạm vi nhiệt độ 25-30oC. Một số loài có khả năng phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng nấm đối kháng Trichoderma phát triển tốt ở 25-30oC, nhưng phạm vi nhiệt độ có thể phát triển được từ 15- 35oC. Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T. asperellum
ở các nhiệt độ 20, 25, 30 và 35oC (bảng 4.6, hình 4.6).
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
Nhiệt độ (oC)
Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
1 2 3 4 5 6 20 8,8d 15,7d 30,8c 48,3b 67,5b 90,0a 25 34,5a 67,3a 90,0a 90,0a 90,0a 90,0a 30 15,3b 57,5b 90,0a 90,0a 90,0a 90,0a 35 13,3c 34,5c 61,3b 90a 90,0a 90,0a LSD0,05 0,78 1,06 0,44 0,57 0,49 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Kết quả cho thấy nấm T. asperellum phát triển tốt ở 20oC – 35oC. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp 200C nấm T. asperellum sinh trưởng phát triển chậm hơn, sau 3 ngày đường kính tản nấm chỉ đạt 30,8mm. Trong khi đó ở nhiệt độ 250C – 300C, sau 3 ngày đường kính tản nấm đạt mức 90mm. Nấm sinh trưởng phát triển chậm hơn ở nhiệt độ 35oC.
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của T. asperellum.
4.2.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nấm T. asperellum sống và tồn tại trong đất. Do vậy, pH đất cũng đóng một vai trò quan trọng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tồn tại của nấm
T. asperellum. Đa số, các vi sinh vật trong đất đều phát triển tốt ở pH6-8. Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T. asperellum ở các mức pH từ 4-8 (bảng 4.7). Sự phát triển của nấm T. asperellum được đánh giá bằng cách đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3 và 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy (PDA) đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
pH Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
1 2 3 4 4 15,5c 59,2b 83,7c 90,0a 5 16,3b 59,5b 90,0a 90,0a 6 20,3a 68,5a 90,0a 90,0a 7 20,0a 62,7b 90,0a 90,0a 8 16,3b 60,7b 85,7b 90,0a LSD0,05 0,78 2,15 1,78 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05. Chuẩn pH môi trường sử dụng HCl 1N và NaOH 1N bằng máy đo độ pH Milwaukee (Mỹ).
Hình 4.7. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm T. asperellum có khả năng sinh trưởng, phát triển được ở cả 5 mức pH khác nhau từ pH4 đến pH8. Tuy nhiên, ở mức pH4 và pH8 nấm T. asperellum phát triển chậm, sau 4 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm là 90mm. Trong khi đó, ở pH 5-7 nấm T. asperellum phát triển rất tốt, sau 3 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm là 90mm. Các kết quả nghiên cứu của Romero-Arenas et al. (2012) cũng cho kết quả tương tự khi nghiên cứu về nấm
T. viride. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng, khi ứng dụng nấm T. asperellum để phòng trừ các bệnh nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất cần chú ý ứng dụng trên các nền đất có pH5-7, không nên ứng dụng trên các nền đất có pH chua hoặc kiềm.
4.3. NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM TRÊN MỘT SỐ CƠ CHẤT ĐỂ LÀM NGUỒN TẠO CHẾ PHẨM TRICHODERMA
4.3.1. Nhân sinh khối nấm Trichoderma asperellum
Việc nghiên cứu và chọn giá thể thích hợp để nhân sinh khối nấm
T. asperellum phải đảm bảo được nguồn giá thể phải dễ tìm, giá thành rẻ và thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển cà sinh sản của nấm. Để nghiên cứu giá thể thích hợp nhân sinh khối nấm T. asperellum chúng tôi tiến hành chọn các loại giá thể giá rẻ, thuận lợi cho việc nhân sinh khối với số lượng lớn (bảng 4.8).
Bảng 4.8. Sự hình thành bào tử của nấm Trichoderma asperellum trên các giá thể khác nhau
Ngày
theo dõi Bã mía
Bã cây
diêm mạch Bột ngô Trấu cám Thóc luộc
3 - - - - - 5 - - 2,4 x 104 1,9 x 103 2,3 x 104 7 1,1 x 102 - 4,5 x 105 4,3 x 106 4,9 x 106 9 1,8 x 103 - 5,5 x 107 5,1 x 108 5,3 x 108 11 2,5 x 103 - 7,2 x 108 7,0 x 108 7,8 x 109 a) b) c) d) e)
Hình 4.8. Nhân nuôi nấm Trichoderma asperellum trên một số giá thể. a) bã mía, b) bã diêm mạch, c) bột ngô, d) trấu cám và e) thóc luộc
Kết quả cho thấy sau 3 - 4 ngày các sợi nấm đã phát triển, lan trên bề mặt, có màu xanh nhạt, sau đó chế phẩm phát triển mạnh chuyển dần thành màu xanh đậm. Tuy nhiên khi đếm mật độ bào tử có xử lý thống kê cho thấy các công thức cũng có sự sai khác. Môi trường thóc luộc có độ xốp cao, thoáng khí hơn, cho mật độ bào tử cao nhất 7,8 x 109 cfu/g sau 11 ngày nhân nuôi bào tử mọc kín có màu xanh đậm. Tiếp đến là môi trường bột ngô và trấu cám có mật độ bào tử lần lượt là 7,2 x 108 cfu/g và 7,0 x 108 cfu/g. Từ đó chúng ta thấy rằng tùy theo yêu cầu chế phẩm được sử dụng trong điều kiện nào thì chúng ta sẽ sử dụng môi trường nhân tạo nhân nuôi cho thích hợp. Nếu sử dụng để bón gốc, ủ phân chuồng thì chúng ta sẽ nhân nuôi trên môi trường thóc luộc hoặc trấu cám, nếu sử dụng để pha dạng phun thì sử dụng môi trường bột ngô sẽ tạo bột mịn hơn, dễ hòa tan.
Ngược lại, nấm T. asperellum không phát triển được trên giá thể là bã cây diêm mạch khô, lý do có thể trong bã cây diêm mạch có thể chứa chất ức chế mà không thuận lợi cho sự sinh trưởng của nấm Trichoderma. Như vậy, môi trường thóc luộc hoặc trấu cám có thể được chọn làm giá thể để nhân sinh khối nấm
T. asperrelum.
4.3.2. Tạo chế phẩm chứa nấm T. asperrellum
Để thuận tiện cho việc phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất nói chung và bệnh lở cổ rễ, thối hạch bắp cải nói riêng cần tạo chế phẩm chứa nấm Trichoderma. Hiện tại, đã có một số chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma đã được thương mai hóa như ViĐK, TBTricho,... Trong nghiên cứu này, xuất phát từ sự phân lập và đánh giá sự phát triển của nấm T. asperellum, là nấm sinh trưởng phát triển nhanh trên môi trường thóc luộc và hình thành số lượng lớn bào tử lớn trong thời gian ngắn nên chúng tôi đã sử dụng để nhân sinh khối thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh ngoài đồng ruộng.
Trước tiên, chuẩn bị nguồn nấm cấp 2 được cấy từ ống nghiệm ra đĩa Petri chứa môi trường PDA, sau đó cấy chuyển sang môi trường lỏng (Broth Potato Agar)(Sơ đồ 1) để nhân được nhiều sinh khối (hình 4a-b). Sử dụng các loại thóc kém chất lượng, không dùng làm thực phẩm, luộc và hấp khử trùng ở 121oC, 1,5 atm trong thời gian 30 phút. Để nguội và cấy nấm cấp 2 từ môi trường lỏng vào khay chứa giá thể lóc luộc. Các khay được giữ ở nhiệt độ phòng (25oC-30oC) trong. Khi hình thành nhiều bào tử thì phối trộn với bột Talc để tạo chế phẩm.
a) b)
c) d)
Hình 4.9. Quy trình tạo chế phẩm chứa nấm Trichoderma asperellum. a) chuẩn bị môi trường lỏng, b) nuôi lắc trong môi trường lỏng, c) nhân sinh khối trên giá thể thóc luộc và d) phối trộn với bột talc tạo chế
phẩm Trichoderma
4.4. NGHIÊN CỨU SỨC SỐNG CỦA BÀO TỬ NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM SAU KHI PHỐI TRỘN VỚI PHÂN BÓN ASPERELLUM SAU KHI PHỐI TRỘN VỚI PHÂN BÓN
Hiệu quả phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất của chế phẩm chứa nấm T. asperellum sẽ tăng khi được phối trộn hoặc bón cùng với phân bón hữu cơ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa nấm T. asperellum với phân bón hữu cơ lục thần nông. Sau khi phối trộn, hỗn hợp được bảo quản ở nhiệt độ phòng và kiểm tra định kỳ để đánh giá khả năng sống của bào tử nấm T. asperellum sau khi phối trộn với phân bón hữu cơ. Trong quá trình bảo quản nấm, định kỳ 3 tháng 1 lần chúng tôi tiến hành lấy nấm và cấy lại trên môi trường PDA, đo đường kín tản nấm và xác định số bào tử /ml, kết quả được ghi ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Khả năng phát triển của nấm Trichoderma asperellum sau khi bảo quản
Thời gian bảo quản
Đường kính tản nấm (mm) sau cấy Số bào tử /1 ml Sau khi cấy 9 ngày Tỷ lệ nảy mầm (%) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 3 tháng 17,3a 54,3a 66,4b 82,5b 90a 90 5201x105 76,8 6 tháng 16,5a 50,4a 74,4a 90,0a 90a 90 5122x105 76,2 9 tháng 15,7a 54,3a 65,2b 77,7c 90a 90 5106x105 75,5 12 tháng 14,8b 52,3a 67,4b 78,0c 90a 90 5012x105 74,8 LSD0,05 0,89 2,91 1,47 3,64 0 0 - -
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Hình 4.10. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng phát triển của nấm T.asperellum
Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy bảo quản chế phẩm Trichoderma sau thời gian 3, 6, 9, 12 tháng khi cấy lên môi trường PDA, nấm vẫn phát triển bình thường, sau khi cấy 1 ngày, đường kính tản nấm đạt từ 13,6mm đến 17,5mm, các ngày sau đó nấm tiếp tục phát triển đến ngày thứ 5 nấm đã phát triển kín đĩa (đường kính tản nấm 90mm).
Từ ngày thứ 3 sau khi cấy, nấm đã bắt đầu hình thành bào tử nhưng chưa nhiều, đến ngày thứ 9 sau khi cấy chúng tôi xác định số lượng bào tử nấm ml cho thấy số lượng bào tử nấm đạt từ 5012 x105 cfu/1ml đến 5201x105cfu/1ml, tỷ lệ nảy mầm của bào tử từ 74,8% đến 76,8%.
4.5. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA MỨC ĐỘ BỆNH THỐI HẠCH VÀ LỞ CỔ RỄ BẮP CẢI TẠI HÀ NỘI VÀ LÀO CAI BẮP CẢI TẠI HÀ NỘI VÀ LÀO CAI
4.5.1. Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch, lở cổ rễ tại Lào Cai
4.5.1.1. Kết quả điều tra và thu thập bệnh lở cổ rễ tại Lào Cai
Bệnh lở cổ rễ cây bắp cải do nấm Rhizoctonia solani gây hại chủ yếu ở giai đoạn vườn ươm. Tại Lào Cai, kết quả điều tra cũng cho thấy bệnh lở cổ rễ là một trong những bệnh gây hại nhất trong giai đoạn vườn ươm cây con. Triệu chứng bệnh điển hình là phần cổ rễ, gốc thân bị teo thắt, cây con bị chết rạp, đổ gục (hình 4.11). Khi bệnh hại nặng, mật độ cây con giảm nghiêm trọng.
Bảng 4.10. Tỷ lệ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải (Rhizoctonia solani) tại Lào Cai
Địa điểm Giai đoạn
sinh trưởng Bộ phận bị hại
Tỷ lệ bệnh (%)
Bảo Thắng Cây con 2-3 lá cổ rễ 5,0 Bắc Hà Cây con 2-3 lá cổ rễ 1,0 Sapa Cây con 2-3 lá cổ rễ 3,0 Bảo Yên Cây con 2-3 lá cổ rễ 1,0 TP Lào Cai Cây con 2-3 lá cổ rễ 3,0
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh lở cổ rễ bắp cải do nấm R. solani gây hại ở tất cả các vùng điều tra Bảo Thắng, Bắc Hà, Sapa, Bảo Yên và TP Lào Cai. Tỷ lệ bệnh hại từ 1,0 – 5,0% (bảng 4.10). Đây là những vùng không trồng độc canh nên có tỷ lệ bệnh hại nhẹ, cao nhất là 5,0% tại Bảo Thắng vì hộ nông dân này thường tròng cây rau mầu trên cùng chân đất, ít khi luân canh với lúa nước. Triệu chứng điển hình là gây hại ở giai đoạn cây con trong vườn ươm hoặc cây được 2- 3 lá thật, làm lở cổ rễ, rễ teo thắt, cây chết (hình 4.11).
a) b) c)
Hình 4.11. Triệu chứng bệnh lở cổ rễ cải bắp. a-b) triệu chứng lở cổ rễ cây con trong vườm ươm và c) triệu chứng lở cổ rễ trên ruộng trồng con trong vườm ươm và c) triệu chứng lở cổ rễ trên ruộng trồng
(giai đoạn trải lá bàng)
Trong một số trường hợp, bệnh hại cả vùng cổ rễ ở một số cây ở giai đoạn trải lá bàng (hình 4.11c). Kết quả phân lập nấm gây bệnh cho thấy tản nấm phát triển nhanh trên môi trường PDA, có màu nâu (hình 4.12a). Sợi nấm đa bào, phân nhánh và gần vuông góc với sợi chính, tại vị trí phân nhánh hơi thắt (hình 4.12b). Quan sát các đặc điểm hình thái tản nấm, màu sắc, cấu tạo của sợi nấm cho thấy nguyên nhân gây bệnh do nấm R. solani. Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về bệnh lở cổ rễ do nấm R. solani gây hại và các biện pháp phòng trừ cũng chủ yếu là sử dụng chế phẩm sinh học.
a) b)
Hình 4.12. Đặc điểm hình thái tản nấm và sợi nấm trên môi trường PDA. a) Tản nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PDA và b) Sợi nấm R. a) Tản nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PDA và b) Sợi nấm R. solani phân nhánh, hình ống, tại chỗ phân nhánh hơi thắt và có vách ngăn