PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC CỦA NẤM TRICHODERMA SP. 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu đất để phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. tại một số tỉnh miền Bắc
Nấm Trichoderma sp. có nhiều trong đất tự nhiên, trong đó nhiều chủng
Trichoderma sp. như Trichoderma viride, T. harzianum, T. aperellum,... có khả năng đối kháng lại các tác nhân gây bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất như nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, F. oxysporum,
Pythium sp., Phytophthora nicotiana. Hiện tại, việc xác định các loài nấm
Trichoderma sp. ở miền Bắc của Việt Nam chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Để định danh nấm chính xác hơn và lựa chọn được những chủng nấm
Trichoderma sp. có khả năng phòng trừ tốt đối với các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trong đất chúng tôi tiến hành định danh bằng kỹ thuật phân tử. Trong nghiên cứu này, 18 mẫu đất ở các cánh đồng trồng cây hoa mầu (bảng 4.1),...đã được thu tập từ một số tỉnh thuộc miền Bắc làm vật liệu để phân lập nấm
Trichoderma sp.
Bảng 4.1. Danh sách mẫu đất đã được thu thập để phân lập nấm
Trichoderma sp. trong nghiên cứu này
Ký hiệu
mẫu Địa điểm
Ruộng cây trồng Năm thu thập Số mẫu thu thập
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2015 02 Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Mía 2015 02 Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Đậu tương 2015 02 Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh, Hà Nội Cà chua 2015 02 Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch 2016 02 Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2016 02 Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi 2016 02 Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Rau cải 2017 02 Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Cà chua 2017 02
4.1.2. Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. tại một số tỉnh miền Bắc miền Bắc
Các mẫu đất sau khi thu thập về được phơi khô, nghiền mịn và hòa loãng trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 100 gram đất : 1000 ml nước cất vô trùng. Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al. (2017). Xác định nấm Trichoderma sp. theo phương pháp của Flegel (1980). Sau cùng, để làm thuần nấm Trichoderma sp., kỹ thuật cấy đơn bào tử sử dụng kim thủy tinh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kỹ thuật cấy ria (cấy vi khuẩn) được sử dụng. Kết quả cho thấy các mẫu đất thu thấp được đều có nấm Trichoderma sp. bước đầu dựa vào đặc điểm hình thái trên môi trường nhân tạo PDA (bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. từ các mẫu đất đã thu thập
Ký hiệu
mẫu Địa điểm thu thập
Đặc điểm tản nấm trên môi trường PDA
Giám định dựa vào hình thái
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh,
Hà Nội
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Vn.05 Cao Bằng Trắng, ít bào tử Trichoderma sp. Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà
Nội
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Quan sát các mẫu nấm Trichoderma sp. trên môi trường PDA lúc đầu tản nấm có màu trắng, sau chuyển dần sang màu xanh (bắt đầu hình thành bào tử phân sinh). Bào tử phân sinh của nấm có dạng hình cầu hoặc hình trứng, trơn nhẵn. Thể bình có dạng hình trụ. Đa số các mẫu thu thập được hình thành nhiều
bào tử phân sinh sau 3 ngày nuôi cấy và đến ngày thứ 4 và thứ 5 thì nấm mọc kín đĩa và chuyển xanh hoàn toàn (hình 4.1).
(h) (i)
Hình 4.1 Các mẫu nấm Trichoderma spp. đã phân lập thuần trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy. a) VnTri 01, b) VnTri02, c) VnTri03, d)
VnTri04, e) VnTri05, f) VnTri06, g) VnTri07, h) VnTri08 và i) VnTri09.
Trong các mẫu Trichoderma phân lập được từ các mẫu đất, chúng tôi thấy rằng đa số các mẫu có đặc điểm tản nấm, hình thái giống nhau (hình 4.1a-d, f-g và i). 01 mẫu mọc thưa thớt và ít bào tử (hình 4.1e) và 01 mẫu nấm có đặc điểm tản nấm,hình thái khác so với các mẫu trên (hình 4.1h). Vì vậy, để giám định chính xác tên các mẫu nấm Trichoderma thu thập được, giống như việc giám định tên các loài nấm gây bệnh khác, phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay là nhân vùng gen rDNA-ITS của nấm (sau khi nuôi cấy thuần trên môi trường PDA từ 7-10 ngày) bằng cặp mồi ITS4 và ITS5. Sản phẩm PCR thu được sẽ được tinh sạch bằng kit tinh sạch thương mại. DNA của nấm được giải trình tự tại hãng Macrogen của Hàn Quốc. Kết quả được trình bày ở mục 4.1.3.
4.1.3. Kết quả xác định các mẫu nấm đối kháng dựa vào giải trình tự gene vùng rDNA-ITS.
Vn.02 λDNA Vn.03 Vn.04 Vn.05 Vn.06 Vn.07
λDNA Vn.08 Vn.09
Hình 4.2 Sản phẩm điện di các mẫu nấm đối kháng Trichoderma Vn.01- Vn.09. Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp
Bảng 4.3. Kết quả tìm kiếm chuỗi gần gũi trên ngân hàng gen của 09 mẫu nấm Trichoderma Mẫu phân lập Tên loài đồng nhất % đoạn so sánh Mức độ đồng nhất (%) Mã số GenBank
VnTri1 Trichoderma asperellum 100 100 KY623504,KY582181,KX1 46490
VnTri2 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472, U341014
VnTri3 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri4 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri5 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri6 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri7 Trichoderma asperellum 100 100 -
VnTri8 Trichoderma harzianum 100 100 KX381171,MF108889,KY76 4862
VnTri9 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472, U341014
Nghiên cứu này đã xác định được 08 mẫu nấm Trichoderma sp. là
Trichoderma asperellum, 01 mẫu nấm là Trichoderma harzianum. Như vậy, số lượng mẫu nấm Trichoderma asperellum là phổ biến trong đất trồng rau màu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Chính vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mẫu nấm Trichoderma asperellum. Phân tích phả hệ các mẫu nấm Trichoderma spp. (hình 4.3) cho thấy mẫu nấm
Trichoderma phân lập ở một số tỉnh miền Bắc thuộc 2 cụm T. asperellum và
T. harzianum (được bôi đen, đậm trong hình 4.3).
Hình 4.3 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của 09 mẫu nấm
Trichoderma. Phân tích được thực hiện theo phương pháp Neighbor-Joining với 1000 lần lặp (MEGA 7.0). Các mẫu của miền Bắc Việt Nam thuộc 2
nhóm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum
●1A9BZAA003-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA007-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA001-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA000-Trichoderma asperellum
KY318472-Trichoderma asperellum
KX681729-Trichoderma asperellum
KU341014-Trichoderma asperellum
●Vn.Tri01-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA002-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA004-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA005-Trichoderma asperellum
AY380909-Trichoderma asperellum
EU732725-Trichoderma asperellum
KX381171-Trichoderma harzianum
KY764862-Trichoderma harzianum
MF108889-Trichoderma harzianum
●1A9BZAA006-Trichoderma harzianum
AF456909- Trichoderma koningii
DQ367683-Trichoderma koningii DQ341181-Trichoderma koningii DQ367694-Trichoderma koningii 92 72 83 99 89 18 85 54 0.20