ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC CỦA NẤM TRICHODERMA SP. 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu đất để phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. tại một số tỉnh miền Bắc
Nấm Trichoderma sp. có nhiều trong đất tự nhiên, trong đó nhiều chủng
Trichoderma sp. như Trichoderma viride, T. harzianum, T. aperellum,... có khả năng đối kháng lại các tác nhân gây bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất như nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, F. oxysporum,
Pythium sp., Phytophthora nicotiana. Hiện tại, việc xác định các loài nấm
Trichoderma sp. ở miền Bắc của Việt Nam chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Để định danh nấm chính xác hơn và lựa chọn được những chủng nấm
Trichoderma sp. có khả năng phòng trừ tốt đối với các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trong đất chúng tôi tiến hành định danh bằng kỹ thuật phân tử. Trong nghiên cứu này, 18 mẫu đất ở các cánh đồng trồng cây hoa mầu (bảng 4.1),...đã được thu tập từ một số tỉnh thuộc miền Bắc làm vật liệu để phân lập nấm
Trichoderma sp.
Bảng 4.1. Danh sách mẫu đất đã được thu thập để phân lập nấm
Trichoderma sp. trong nghiên cứu này
Ký hiệu
mẫu Địa điểm
Ruộng cây trồng Năm thu thập Số mẫu thu thập
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2015 02 Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Mía 2015 02 Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Đậu tương 2015 02 Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh, Hà Nội Cà chua 2015 02 Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch 2016 02 Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2016 02 Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi 2016 02 Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Rau cải 2017 02 Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Cà chua 2017 02
4.1.2. Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. tại một số tỉnh miền Bắc miền Bắc
Các mẫu đất sau khi thu thập về được phơi khô, nghiền mịn và hòa loãng trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 100 gram đất : 1000 ml nước cất vô trùng. Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al. (2017). Xác định nấm Trichoderma sp. theo phương pháp của Flegel (1980). Sau cùng, để làm thuần nấm Trichoderma sp., kỹ thuật cấy đơn bào tử sử dụng kim thủy tinh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kỹ thuật cấy ria (cấy vi khuẩn) được sử dụng. Kết quả cho thấy các mẫu đất thu thấp được đều có nấm Trichoderma sp. bước đầu dựa vào đặc điểm hình thái trên môi trường nhân tạo PDA (bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. từ các mẫu đất đã thu thập
Ký hiệu
mẫu Địa điểm thu thập
Đặc điểm tản nấm trên môi trường PDA
Giám định dựa vào hình thái
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh,
Hà Nội
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Vn.05 Cao Bằng Trắng, ít bào tử Trichoderma sp. Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà
Nội
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp. Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp.
Quan sát các mẫu nấm Trichoderma sp. trên môi trường PDA lúc đầu tản nấm có màu trắng, sau chuyển dần sang màu xanh (bắt đầu hình thành bào tử phân sinh). Bào tử phân sinh của nấm có dạng hình cầu hoặc hình trứng, trơn nhẵn. Thể bình có dạng hình trụ. Đa số các mẫu thu thập được hình thành nhiều
bào tử phân sinh sau 3 ngày nuôi cấy và đến ngày thứ 4 và thứ 5 thì nấm mọc kín đĩa và chuyển xanh hoàn toàn (hình 4.1).
(h) (i)
Hình 4.1 Các mẫu nấm Trichoderma spp. đã phân lập thuần trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy. a) VnTri 01, b) VnTri02, c) VnTri03, d)
VnTri04, e) VnTri05, f) VnTri06, g) VnTri07, h) VnTri08 và i) VnTri09.
Trong các mẫu Trichoderma phân lập được từ các mẫu đất, chúng tôi thấy rằng đa số các mẫu có đặc điểm tản nấm, hình thái giống nhau (hình 4.1a-d, f-g và i). 01 mẫu mọc thưa thớt và ít bào tử (hình 4.1e) và 01 mẫu nấm có đặc điểm tản nấm,hình thái khác so với các mẫu trên (hình 4.1h). Vì vậy, để giám định chính xác tên các mẫu nấm Trichoderma thu thập được, giống như việc giám định tên các loài nấm gây bệnh khác, phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay là nhân vùng gen rDNA-ITS của nấm (sau khi nuôi cấy thuần trên môi trường PDA từ 7-10 ngày) bằng cặp mồi ITS4 và ITS5. Sản phẩm PCR thu được sẽ được tinh sạch bằng kit tinh sạch thương mại. DNA của nấm được giải trình tự tại hãng Macrogen của Hàn Quốc. Kết quả được trình bày ở mục 4.1.3.
4.1.3. Kết quả xác định các mẫu nấm đối kháng dựa vào giải trình tự gene vùng rDNA-ITS.
Vn.02 λDNA Vn.03 Vn.04 Vn.05 Vn.06 Vn.07
λDNA Vn.08 Vn.09
Hình 4.2 Sản phẩm điện di các mẫu nấm đối kháng Trichoderma Vn.01- Vn.09. Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp
Bảng 4.3. Kết quả tìm kiếm chuỗi gần gũi trên ngân hàng gen của 09 mẫu nấm Trichoderma Mẫu phân lập Tên loài đồng nhất % đoạn so sánh Mức độ đồng nhất (%) Mã số GenBank
VnTri1 Trichoderma asperellum 100 100 KY623504,KY582181,KX1 46490
VnTri2 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472, U341014
VnTri3 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri4 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri5 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri6 Trichoderma asperellum 100 100 - VnTri7 Trichoderma asperellum 100 100 -
VnTri8 Trichoderma harzianum 100 100 KX381171,MF108889,KY76 4862
VnTri9 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472, U341014
Nghiên cứu này đã xác định được 08 mẫu nấm Trichoderma sp. là
Trichoderma asperellum, 01 mẫu nấm là Trichoderma harzianum. Như vậy, số lượng mẫu nấm Trichoderma asperellum là phổ biến trong đất trồng rau màu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Chính vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mẫu nấm Trichoderma asperellum. Phân tích phả hệ các mẫu nấm Trichoderma spp. (hình 4.3) cho thấy mẫu nấm
Trichoderma phân lập ở một số tỉnh miền Bắc thuộc 2 cụm T. asperellum và
T. harzianum (được bôi đen, đậm trong hình 4.3).
Hình 4.3 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của 09 mẫu nấm
Trichoderma. Phân tích được thực hiện theo phương pháp Neighbor-Joining với 1000 lần lặp (MEGA 7.0). Các mẫu của miền Bắc Việt Nam thuộc 2
nhóm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum
●1A9BZAA003-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA007-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA001-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA000-Trichoderma asperellum
KY318472-Trichoderma asperellum
KX681729-Trichoderma asperellum
KU341014-Trichoderma asperellum
●Vn.Tri01-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA002-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA004-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA005-Trichoderma asperellum
AY380909-Trichoderma asperellum
EU732725-Trichoderma asperellum
KX381171-Trichoderma harzianum
KY764862-Trichoderma harzianum
MF108889-Trichoderma harzianum
●1A9BZAA006-Trichoderma harzianum
AF456909- Trichoderma koningii
DQ367683-Trichoderma koningii DQ341181-Trichoderma koningii DQ367694-Trichoderma koningii 92 72 83 99 89 18 85 54 0.20
4.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC CỦA CÁC MẪU NẤM
TRICHODERMA
4.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum harzianum
Sau khi xác định được các mẫu nấm Trichoderma thu thập được ở một số tỉnh miền Bắc gồm T. asperellum và T. harzianum, chúng tôi đã cấy nấm trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28-30oC, quan sát sự phát triển của nấm, đặc điểm của tản nấm (bảng 4.4; hình 4.4a-b). Tản nấm T. asperellum phát triển nhanh và hình thành nhiều bào tử phân sinh hơn nấm T. harzianum. Thể bình của nấm
T. harzianum mọc đối xứng nhau và vuông góc với cành bào tử phân sinh (hình 4.4b), trong khi đó thể bình của nấm T. asperellum mọc đối xứng và thành chùm 2-3 thể bình trên đầu cành bào tử phân sinh (hình 4.4a). Từ thể bình hình thành các bào tử phân sinh, bào tử phân sinh của 2 nấm đều tròn tròn hoặc bầu dục. Kích thước bào tử trung bình 2,9-3,1 x 2,3-3,3 μm (hình 4.4c-d).
Bảng 4.4. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma
Ký hiệu
mẫu Địa điểm
Ruộng cây trồng
Năm thu thập
Đặc điểm trên môi trường PDA
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2015 Xanh, nhiều bào tử Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Bã Mía 2015 Xanh, nhiều bào tử Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Đậu tương 2015 Xanh, nhiều bào tử Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh,
Hà Nội Cà chua 2015 Xanh, nhiều bào tử Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch 2016 Trắng, ít bào tử Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà
Nội Tỏi 2016 Xanh, nhiều bào tử Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi 2016 Xanh, nhiều bào tử Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Rau cải 2017 Xanh, hơi vàng,
nhiều bào tử Vn.09 Tiên Du Bắc Ninh Cà chua 2017 Xanh, nhiều bào tử
Cả 2 nấm T. asperellum và T. harzianum đều phát triển khá nhanh, sau 4-5 ngày nuôi cấy, tản nấm đều phát triển được 90mm. Tuy nhiên, nấm T. asperellum
phát triển nhanh hơn và khả năng hình thành bào tử phân sinh nhiều hơn. Như vậy, sẽ thuận lợi trong việc nhân sinh khối để tạo chế phẩm nấm Trichoderma.
a) b)
c) d)
Hình 4.4. Đặc điểm hình thái của mẫu nấm a) Tản nấm trên môi trường PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phân sinh
T.asperellum. b) Tản nấm trên môi trường PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phân sinh T. harzianum. Thanh bar 10µm.
Xuất phát từ sự phổ biến, tốc độ phát triển và hình thành bào tử phân sinh rất nhanh của nấm T. asperellum. Hơn nữa, đã lần đầu xác định sự có mặt của nấm T. asperellum ở đất trồng rau mầu của một số tỉnh miền Bắc. Vì vậy, trong nghiên cứu này đã chọn nấm T. asperellum để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo như đặc điểm sinh học, nhân sinh khối, thử khả năng ức chế đối với một số nấm gây bệnh cũng như thử khả năng phòng trừ một số bệnh hại quan trọng như bệnh lở cổ rễ cây con bắp cải và bệnh thối hạch bắp cải ngoài sản xuất nhằm so sánh với các nguồn nấm Trichoderma sp. trước đây như T. viride, T. harzianum,...
4.2.2. Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma asperellum
4.2.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Vi sinh vật nói chung và nấm đối kháng nói riêng, môi trường dinh dưỡng đóng một vai trò quan trọng trọng sự phát triển và sinh sản (hình thành bào tử phân sinh) của nấm. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma
phát triển thuận lợi trên môi trường PDA và một số môi trường khác như PSA, PCA...Vì vậy, trong nghiên cứu này cũng đã khảo sát sự phát triển của nấm
T. asperellum trên một số môi trường như PDA, PSA và OMA (bảng 4.5).
Bảng 4.5. Khả năng phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Môi trường
Đường kính tản nấm (mm) sau cấy (ngày) Số bào tử /1 ml sau cấy 9 ngày
1 2 3 4 5 6
PDA 19,5a 58,5a 83,3a 90,0a 90,0 90,0 5464 x 105 PSA 19,5a 55,5b 79,4b 85,0b 90,0 90,0 5322 x 105 OMA 13,5b 44,5b 73,0c 84,0b 90,0 90,0 5136 x 105 LSD0,05 1,41 2,81 2,38 1,73 0 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Hình 4.5. Sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Kết quả cho thấy, cũng giống như nhiều nấm gây bệnh và các nấm đối kháng Trichoderma sp. khác, nấm T. asperellum phát triển thuận lợi trên các môi trường PSA, PDA và OMA. Tuy nhiên, nấm phát triển tốt nhất trên môi trường PDA, sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm là 90mm. Khả năng hình thành bào tử phân sinh trên cả 3 môi trường này cũng khá nhanh. Ở môi trường PDA sau 9 ngày nuôi cấy cho số bào tử/1ml cao nhất, đạt 5464 x 105. Như vậy, môi trường PDA sẽ được chọn là môi trường dùng để nhân nguồn nấm từ giống cấp 1 để tạo nguồn ban đầu cho việc nhân sinh khối nấm Trichoderma.
4.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và nấm đối kháng nói riêng. Đa số các vi sinh vật đặc biệt là nấm gây bệnh phát triển và gây hại trong phạm vi nhiệt độ 25-30oC. Một số loài có khả năng phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng nấm đối kháng Trichoderma phát triển tốt ở 25-30oC, nhưng phạm vi nhiệt độ có thể phát triển được từ 15- 35oC. Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T. asperellum
ở các nhiệt độ 20, 25, 30 và 35oC (bảng 4.6, hình 4.6).
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
Nhiệt độ (oC)
Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
1 2 3 4 5 6 20 8,8d 15,7d 30,8c 48,3b 67,5b 90,0a 25 34,5a 67,3a 90,0a 90,0a 90,0a 90,0a 30 15,3b 57,5b 90,0a 90,0a 90,0a 90,0a 35 13,3c 34,5c 61,3b 90a 90,0a 90,0a LSD0,05 0,78 1,06 0,44 0,57 0,49 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Kết quả cho thấy nấm T. asperellum phát triển tốt ở 20oC – 35oC. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp 200C nấm T. asperellum sinh trưởng phát triển chậm hơn, sau 3 ngày đường kính tản nấm chỉ đạt 30,8mm. Trong khi đó ở nhiệt độ 250C – 300C, sau 3 ngày đường kính tản nấm đạt mức 90mm. Nấm sinh trưởng phát triển chậm hơn ở nhiệt độ 35oC.
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của T. asperellum.
4.2.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nấm T. asperellum sống và tồn tại trong đất. Do vậy, pH đất cũng đóng một vai trò quan trọng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tồn tại của nấm
T. asperellum. Đa số, các vi sinh vật trong đất đều phát triển tốt ở pH6-8. Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T. asperellum ở các mức pH từ 4-8 (bảng 4.7). Sự phát triển của nấm T. asperellum được đánh giá bằng cách đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3 và 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy (PDA) đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
pH Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
1 2 3 4 4 15,5c 59,2b 83,7c 90,0a 5 16,3b 59,5b 90,0a 90,0a 6 20,3a 68,5a 90,0a 90,0a 7 20,0a 62,7b 90,0a 90,0a 8 16,3b 60,7b 85,7b 90,0a LSD0,05 0,78 2,15 1,78 0
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05. Chuẩn pH môi trường sử dụng HCl 1N và NaOH 1N bằng máy đo độ pH Milwaukee (Mỹ).
Hình 4.7. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm T. asperellum có khả năng sinh trưởng, phát triển được ở cả 5 mức pH khác nhau từ pH4 đến pH8. Tuy nhiên, ở mức pH4 và pH8 nấm T. asperellum phát triển chậm, sau 4 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm là 90mm. Trong khi đó, ở pH 5-7 nấm T. asperellum phát triển rất tốt, sau 3 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm là 90mm. Các kết quả nghiên cứu của Romero-Arenas et al. (2012) cũng cho kết quả tương tự khi nghiên cứu về nấm
T. viride. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng, khi ứng dụng nấm T. asperellum để phòng trừ các bệnh nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất cần chú ý ứng dụng trên các nền đất có pH5-7, không nên ứng dụng trên các nền đất có pH chua hoặc kiềm.
4.3. NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM TRÊN MỘT SỐ CƠ CHẤT ĐỂ LÀM NGUỒN TẠO CHẾ PHẨM TRICHODERMA
4.3.1. Nhân sinh khối nấm Trichoderma asperellum
Việc nghiên cứu và chọn giá thể thích hợp để nhân sinh khối nấm
T. asperellum phải đảm bảo được nguồn giá thể phải dễ tìm, giá thành rẻ và thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển cà sinh sản của nấm. Để nghiên cứu giá thể thích hợp nhân sinh khối nấm T. asperellum chúng tôi tiến hành chọn các loại giá thể giá rẻ, thuận lợi cho việc nhân sinh khối với số lượng lớn (bảng 4.8).
Bảng 4.8. Sự hình thành bào tử của nấm Trichoderma asperellum trên các giá thể khác nhau
Ngày
theo dõi Bã mía
Bã cây