3.2.1. Địa điểm
- Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm, nhà lưới số 7 của Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Vùng trồng rau màu tại Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội và Gia Phú - Bảo Thắng – Lào Cai.
3.2.2. Thời gian
Tháng 7/2016 đến tháng 7/2017
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
o Thu thập mẫu đất, phân lập và xác định loài nấm Trichoderma sp. thu thập từ một số vùng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc.
o Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và phẩn tử của các mẫu
Trichoderma sp.
o Tuyển chọn được loài nấm Trichoderma sp. có khả năng ức chế nấm R. solani gây bệnh lở cổ rễ và S. sclerotinia gây bệnh thối hạch cây cải bắp.
o Nghiên cứu nhân sinh khối loài nấm Trichoderma spp. có triển vọng để làm chế phẩm phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải ngoài đồng ruộng.
o Thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây cải bắp trong điều kiện chậu vại.
o Điều tra, đánh giá mức độ nhiễm bệnh bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai
o Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây cải bắp tại Lào Cai và Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma sp. kết hợp với phân bón hữu cơ, phân bón Lục thần nông
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu đất và phân lập nấm Trichoderma
Mẫu đất được thu thập tại các ruộng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam như Hà Nội, Hải Dương, Bắc Ninh, Cao Bằng và Hòa Bình. Mẫu đất được thu thập ở độ sâu 5-20 cm.
Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp hòa loãng đất trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 100 gram đất:1000 ml nước cất vô trùng. Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al. (2017). Xác định nấm Trichoderma sp. theo phương pháp của Flegel (1980).
3.4.2. Phương pháp điều tra mức độ bệnh (tỉ lệ bệnh) lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai
- Điều tra bệnh hại cây trồng theo QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT, do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số 71/2010/TT – BNNPTNT ngày 10 tháng 12 năm 2010.
- Điều tra theo phương pháp 10 điểm chéo góc. - Mỗi điểm điều tra 5 cây.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Tổng số cây bị bệnh
+ Tỉ lệ bệnh (%) = --- x 100 Tổng số cây điều tra
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.4.3.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh, que cấy được sấy khử trùng ở 140 oC trong 2 giờ bằng tủ sấy.
* Môi trường WA (Water agar):
- Thành phần:
- Nước cất: 1000ml. - Agar: 20g.
- Điều chế: Đun sôi nước cất, sau đó cho agar vào khuấy đều cho tan hết rồi đổ vào trong bình tam giác, bịt kín miệng bằng giấy bạc. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 1,5 atm trong 20 phút, để môi trường nguội ở 50oC, sau đó rót vào đĩa Petri.
* Môi trường PDA (Potato Glucose Agar):
- Thành phần:
- Nước cất : 1000ml - Đường glucose : 20g - Agar : 20g - Khoai tây : 200g
- Điều chế:
Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ, cắt hạt lựu, cho vào nồi nước cất chứa 1000ml đun sôi. Sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc, cho thêm nước cất cho đủ 1000ml. Sau đó cho từ từ agar vào khuấy đều rồi cho đường Glucose vào khuấy đều cho tan. Môi trường được cho vào bình tam giác rồi đậy kín bằng giấy bạc. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1,5 atm trong khoảng 20 phút, để nguội 50oC, sau đó rót vào đĩa Petri.
* Môi trường PSA (Potato saccarose agar) và môi trường OMA (Oat meal agar): được điều chế giống môi trường PDA.
3.4.3.2. Phương pháp phân lập nấm Trichoderma từ mẫu đất và nuôi cấy thuần
Các mẫu đật thu thập được phơi khô, nghiền mịn, sau đó pha loãng theo tỷ lệ 100 gram đất:1000 ml nước cất vô trùng. Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al. (2017). Xác định nấm
Trichoderma sp. theo phương pháp của Flegel (1980).
Sử dụng kỹ thuật cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh với sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học (Bộ môn bệnh cây) và phương pháp cấy ria (vi khuẩn) để thu được nguồn nấm Tricoderma sp. thuần sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nguồn nấm thuần sau khi phân lập được giữ theo 2 phương pháp i) trong glycerol 50% và ii) cấy trên môi trường WA và cho bào tử dính vào giấy thấm vô trùng giữ ở trong ống eppendof và giữ ở -20oC.
3.4.3.3. Xác định tên loài nấm Trichoderma spp. bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự vùng rDNA-ITS
* Phương pháp xác định tên loài nấm Trichoderma spp.
Hiện nay, vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA được sử dụng phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và xác định nhiều loài nấm. Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã. Một đơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS4 (ở đầu 5’) và ITS5 (ở đầu 3’). Các vùng ITS, do có tốc độ đột biến nhìn chung tương ứng với tốc độ biệt hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới mức loài như đã được chứng minh đối với nấm Phytophthora (Duncan and Cooke, 2002).
- PCR và giải trình tự
+ Chuẩn bị khuôn DNA:
DNA của nấm Trichoderma được chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường trong 7 ngày theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA được hòa trong 50 uL đệm TE và bảo quản ở -20oC.
Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB:
+ Ủ đệm CTAB ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút.
+ Cạo sợi nấm cho vào tube 1.5ml, cho 200µl CTAB vào rồi nghiền nhuyễn, cho thêm 500µl CTAB.
+ Đem ủ ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút sau đó để nguội, ly tâm trong 5 phút.
+ Hút 700µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút.
+ Hút 500 – 600µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút.
+ Hút 400µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương isopeopanol vào tube, để lạnh ở -20oC ít nhất trong 30 phút.
+ Lấy ra ly tâm 15 phút, bỏ dịch thu cặn.
+ Rửa với cồn ethanol 70o 2 lần, spin hút cồn ra. + Để khô trong không khí hoặc tủ cấy trong 30 phút.
+ Bổ sung 30 - 50µl TEBf, hòa tan tủa và giữ ở nhiệt độ -20oC. + Phản ứng PCR:
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với chu trình PCR là (94oC trong 5 phút) x 1 chu kỳ, (94o 40 giây, 52o trong 40 giây, 72oC trong 1 phút) x 35 chu kỳ, (72oC trong 5 phút) x 1 chu kỳ, dừng phản ứng ở nhiệt độ phòng.
+ Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết thương mại DNA Gel Extraction Kit (NORGER) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose.
Các bước trong tinh sạch DNA từ agarose gel:
- Thêm 3 lần thể tích Binding Buffer G vào 1 thể tích gel (300 µl Binding Buffer G vào ống 1.5ml chưa 100mg gel)
- Ủ ở 55oC trong thời gian 10 phút đảm bảo gel tan hoàn toàn. Trong thời gian ủ, thỉnh thoảng đảo đều để gel được tan hoàn toàn
- Chuyển 750 µl dung dịch trên vào cột tinh sạch DNA và lý tâm ở 8000 rpm trong thời gian 1 phút, chuyển phần cồn lại của dung dịch và lý tâm tương tự.
- Thêm 500 µl dung dịch Wash Solution A, ly tâm ở 14000 rpm trong thời gian 1 phút. Đổ phần dung dịch sau ly tâm và spin nhẹ
- Thêm 30-50 µl của Elution buffer B để thu lấy DNA. - DNA tinh sạch được giữ ở -20oC sử dụng cho giải trình tự + Giải trình tự gene:
Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR (ITS4 và ITS5) và kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR (gửi thực hiện phản ứng giải trình tự tại hãng Macrogen). Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
- Sử dụng ống eppendof, cho 5 µl DNA và 5 µl mồi ITS4 hoặc ITS 5 (5pmol/ µl). Gửi ống phản ứng twosi hãng Macrogen để thực hiện phản ứng giải trình tự gene.
- Phân tích trình tự và xác định tên loài
Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Từ đó, sẽ xác định được các mẫu Trichoderma spp. thu được giống với loài Trichoderma
spp. nào trên ngân hàng gene. - Phân tích phả hệ
Dựa trên các trình tự thu được và một số trình tự đồng nhất trên Genbank để phân tích phả hệ sử dụng phàn mềm MEGA7.
3.4.3.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma
25oC-30oC để quan sát các đặc điểm như sự phát triển của nấm (đo đường kính tản nấm), màu sắc tản nấm, hình thái của bào tử, mật độ bào tử…sau các ngày nuôi cấy.
3.4.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm
* Nghiên cứu ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của nấm:
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC và 35oC, mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần (3 đĩa Petri).
- Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy.
* Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến sự phát triển của nấm:
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng PH: 4, 5, 6, 7, 8. Mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần (3 đĩa Petri).
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy.
3.4.3.6. Đánh giá và tuyển chọn loài Trichoderma spp. có tiềm năng phòng chống nấm R. solani gây bệnh lở cổ rễ cây và S. sclerotinia gây bệnh thối hạch bắp cải
* Phương pháp đánh giá và tuyển chọn loài Trichoderma sp.
Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. được đánh giá bằng thử nghiệm hiệu lức ức chế đối với nấm gây bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất như nấm Rhizoctonia solani (gây bệnh lở cổ rễ), nấm Sclerotium sclerotinia
(gây bệnh thối hạch) trong điều kiện in vitro. Nấm gây bệnh và nấm đối kháng được cấy đối xứng nhau trên cùng đĩa môi trường PDA và cách nhau khoảng 2 cm theo 1) đốichứng: cấy nấm đối kháng và nấm gây bệnh riêng rẽ, 2) cấy nấm đối kháng trước nấm gây bệnh 24 giờ, 3) cấy nấm đối kháng sau nấm gây bệnh 24 giờ và 4) cấy đồng thời nấm đối kháng và nấm gây bệnh.
Nấm đối kháng
Trichoderma spp.
Nấm bệnh
Sclerotium rolfsii Rhizoctoni solani
Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh được phân thành 4 mức độ kháng (Nguyễn Thị Thuần và cs., 1996; Trần Kim Long và cs., 2009) như sau:
+ Đối kháng cao (+++): Nấm Trichoderma spp. ức chế nấm gây bệnh ≥ 60%.
+ Đối kháng trung bình (++): Nấm Trichoderma spp. ức chế nấm gây bệnh ≥ 40-59.
+ Đối kháng yếu (+): Nấm Trichoderma spp. ức chế nấm gây bệnh ≤ 40-20. + Không đối kháng (-): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≤ 19. - Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (cm) của nấm gây bệnh và nấm
Trichoderma spp. trong 5-7 ngày nuôi cấy.
- Hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh được tính theo công thức Abbott:
C - T
H(%) = --- x 100 C
Trong đó:
H: là hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma spp. C: Đường kính tản nấm gây bệnh ở công thức đối chứng T: Đường kính tản nấm gây bệnh ở công thức thí nghiệm
Sau khi tuyển chọn được chủng Trichoderma sp. có triển vọng trong phòng trừ nấm gây bệnh có nguồn gốc trong đất. Chúng này sẽ được nghiên cứu để nhân nuôi và tạo chế phẩm chứa nấm Trichoderma sp. ứng dụng phòng trừ bệnh ngoài đồng ruộng.
3.4.3.7. Nhân sinh khối và tạo chế phẩm nấm Trichoderma
Theo nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây (1996 - 2000) và một số nghiên cứu của Trần Thị Thuần (1997 - 1999). Môi trường Trấu - cám gạo, bột ngô là rất thích hợp cho sự phát triển của nấm Trichoderma sp. và hình thành sinh khối bào tử lớn. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn môi trường Trấu - cám gạo với các lý do dễ mua, giá thành rẻ.
Trấu - cám gạo được trộn đều theo tỷ lệ 1:1, phun nước cất đủ ẩm, trộn đều, cho vào túi nilon và hấp khử trùng ở 121oC, 1.5 atm trong khoảng 15-20 phút sau đó lấy ra để nguội và tiến hành nhân nuôi tạo sinh khối nấm Trichoderma sp. và tạo chế phẩm chứa nấm Trichoderma sp.
- Chuẩn bị nguồn nấm: Chủng nấm Trichoderma sp. sau khi được giám định chính xác tên loài, được nhân nuôi thuần trên môi trường PDA sau 7 ngày ở nhiệt độ 25oC. Thêm nước cất vô trùng và điều chỉnh để mật độ bào tử đạt 106 bào tử/ml. Sau đó phun vào môi trường trấu - cám gạo và một số môi trường khác như bã mía, bã cây diêm mạch, bột cám, bột ngô. Các khay hay túi nilon chứa môi trường Trấu - cám gạo,... được đặt trong phòng với nhiệt độ 25 - 27oC. Nuôi cấy trong khoảng 7 - 9 ngày để thu được lượng tối đa sinh khối bào tử. Tách riêng bào tử và tạo chế phẩm. Chế phẩm nấm Trichoderma sp. được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian 6 - 12 tháng.
3.4.3.8. Đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh Lục thần nông - Trichoderma
- Phối trộn chế phẩm Trichoderma với phân bón hữu cơ Lục thần nông tạo ra phân hữu cơ vi sinh Lục thần nông – Trichoderma.
- Phân bón hữu cơ được Công ty cổ phân phân bón nông nghiệp 1 hỗ trợ để làm nguồn hỗn hợp với chế phẩm Trichodema.
- Thử nghiệm phòng trừ bệnh ngoài đồng ruộng, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh ở các công thức thí nghiệm khác nhau.
3.4.4. Thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải (giai đoạn cây con) trong nhà lưới trong nhà lưới
+ Đối tượng: Nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ cải bắp, nấm
Sclerotium rolfsii gây bệnh thối hạch bắp cải. + Cây thí nghiệm: bắp cải
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 10 chậu, 3 lần nhắc lại
Công thức 1: Đối chứng (không lây bệnh, không bón LTN-Trichoderma Công thức 2: Chỉ bón phân hữu cơ lục thần nông và Trichoderma
Công thức 3: Lây nhiễm bệnh, không bón LTN-Trichoderma Công thức 4: Lây nhiễm bệnh, bón LTN-Trichoderma
3.4.5. Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải bằng chế phẩm Trichoderma tại Hà Nội và Lào Cai phẩm Trichoderma tại Hà Nội và Lào Cai
Chúng tôi tiến hành bố trí 02 mô hình thử nghiệm (500m2/mô hình) tại Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội và Gia Phú - Bảo Thắng - Lào Cai.
+ Cây thí nghiệm: Cây bắp cải.
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 công thức thí nghiệm.