Hình 3 .1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội
Hình 3.2 Thịt gà bày bán tại chợ sau khi giết mổ
Trong đó số lượng mẫu thu thập tại mỗi chợ là 25 mẫu. Tổng số mẫu phân tích là 100 mẫu.
Các mẫu sau khi thu thập được phân tích tại phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Khoảng thời gian thu thập mẫu từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2016.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Phát hiện, phân lập các chủng Salmonella có trong các mẫu thịt gà thu thập được, từ đó xác định tỉ lệ lưu hành của Salmonella trên thịt gà tại một số chợ trên địa bàn Thành phố Hà Nội.
Thử khả năng kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (thế hệ 1, 2, 3 và β- lactam phổ rộng) của các chủng Salmonella đã phân lập được.
Tìm gen mã hóa enzyme β-lactamase của các chủng Salmonella kháng thuốc.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tơi lựa chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella trên thịt gia cầm, phương pháp dùng khoanh giấy kháng sinh để phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật và kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập, Các gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn bước đầu được phát hiện bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR. Các mẫu dương tính sẽ được lưu lại để thực hiện tiếp các nghiên cứu sâu hơn như phát hiện các đột biến điểm, các gen kháng kháng sinh khác.
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và lưu trữ mẫu 3.3.1.1. Thiết bị, dụng cụ 3.3.1.1. Thiết bị, dụng cụ
- Túi ghép mí đựng mẫu vơ trùng; - Kẹp panh vô trùng;
- Đá khô;
- Hộp giữ nhiệt;
- Tủ mát (Aucma, Nhật Bản);
- Tủ lạnh đông -800C (Daire, Đan Mạch).
3.3.1.2. Nội dung phương pháp
Số lượng 100 mẫu thịt gia cầm được thu thập tại 4 chợ, mỗi chợ 5 mẫu cho 1 lần thu thập, mỗi mẫu khoảng 1/4 con gà (hoặc 1 kg)
Mẫu thịt gà được đựng trong túi nilon ghép mí vơ trùng, bảo quản trong thùng đựng mẫu có kèm đá khô đảm bảo nhiệt độ 40C – 80C. Mẫu được vận chuyển ngay trong ngày về phịng thí nghiệm.
Bảo quản mẫu riêng rẽ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C – 80C tại phịng thí nghiệm nếu phân tích trong ngày, hoặc ở tủ đơng sâu (-20oC) nếu phân tích vào ngày hơm sau. Mẫu đã thu thập từ các chợ sẽ được phân tích trong vịng 24h sau khi thu thập.
3.3.2. Phương pháp phân lập Salmonella 3.3.2.1. Vật liệu nghiên cứu 3.3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị, dụng cụ
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản) - Tủ sấy (Memmert, Đức)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ) - Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ) - Tủ ấm (Binder, Đức)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản) - Tủ lạnh (Panasonic, Malaysia) - Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha) - Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- Máy vortex (IKA, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.10C đơn vị pH ở 200C hoặc 250C (Thụy Sĩ) - Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vịng vơ trùng, có đường kính 3 mm hoặc 10µl - Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vơ trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam - Đèn cồn
- Lam kính Mơi trường, thuốc thử
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức) - MKTTn broth (BD, Pháp)
- RV broth (Merck, Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức) - TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức) - TSA (Merck, Đức)
3.3.2.2. Nội dung phương pháp
Chúng tôi lựa chọn phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) – Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch – để phân tích và phân lập chủng Salmonella do đây là phương pháp đang được tiến hành tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, và đã được đánh giá công nhận bởi Văn phịng cơng nhận chất lượng (BOA).
a/ Nguyên lý
Salmonella có thể có mặt với số lượng nhỏ và thường kèm theo một lượng khá lớn các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteria hoặc các họ khác. Do đó, cần tăng sinh sơ bộ để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella bị suy giảm hoạt tính (TCVN 4829:2005) (Tiêu chuẩn Việt Nam 4829, 2005).
Sau khi tăng sinh sơ bộ, số lượng, hoạt tính của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên, tiến hành tăng sinh chọn lọc tạo điều kiện ức chế những vi khuẩn khác. Những khuẩn lạc Salmonella điển hình được tiến hành thử các phản ứng sinh hóa và thử kháng huyết thanh dựa bằng thử ngưng kết trên phiến kính.
b/ Chủng chuẩn đối chứng trong q trình phân tích
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076 − Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922
c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vơ trùng - Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 18h ± 2h. Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
- Từ dịch tăng sinh sau khi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 18h ± 2h ở bước 1, chuyển 0.1 ml sang 10 ml RV broth (nuôi ở 41.50C ± 10C trong 24h ± 3h) và 1 ml sang 10 ml MKTTn broth (ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h). Bước 3: Ria dịch đã tăng sinh ở bước 2 lên môi trường thạch thứ nhất XLD agar, để yên 30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.. Làm tương tự với môi trường thạch thứ hai HE agar, để yên 30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.
Bước 4: Bắt khuẩn lạc điển hình (khuẩn lạc rìa hồng, tâm đen, nhẵn bóng, lồi, trịn trên XLD agar; và khuẩn lạc rìa khơng màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi trịn trên HE agar) nuôi trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.