Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.4.2. Các phương pháp đánh giá tính kháng kháng sinh – kháng sinh đồ
2.4.2.1. Phương pháp dịch pha loãng
Một trong những phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ sớm nhất là phương pháp dịch pha loãng. Phương pháp này liên quan đến việc chuẩn bị dịch pha loãng của kháng sinh theo cấp độ nhị phân (ví dụ: 1, 2, 4, 8, và 16 mg/ml) trong môi trường chất lỏng phân phối trong ống nghiệm. Các ống chứa kháng sinh được nhiễm dịch vi khuẩn 1-5x105 CFU/ml, tiến hành nuôi qua đêm ở 35°C, các ống đã được kiểm tra độ đục cho thấy sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nồng độ thấp nhất của kháng sinh mà tại đó vi khuẩn khơng phát triển được cho là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Độ chính xác của phương pháp này được coi là cộng hoặc trừ nồng độ đo 1 đến hai lần, do ảnh hưởng của kỹ thuật chuẩn bị độ pha loãng của các kháng sinh. Ưu điểm của kỹ thuật này là đưa ra kết quả định lượng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Các nhược điểm chính của phương pháp là khả năng sai sót trong quá trình chuẩn bị dung dịch kháng sinh, các khả năng sai sót trong việc chuẩn bị kháng sinh, và số lượng tương đối lớn các kháng sinh và hóa chất tham gia trong thử nghiệm, và phải lựa chọn số lượng kháng sinh cứng nhắc khi sử dụng khay kháng sinh đã được thương mại bởi nhà sản xuất (Holmes et al., 2015).
Hình 2.2. Khay kháng sinh 2.4.2.2. Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh. 2.4.2.2. Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh.
Các phương pháp cột khuếch tán kháng sinh sử dụng các nguyên tắc thành lập một cột nồng độ kháng sinh trong một mơi trường để xác định tính nhạy cảm. Các Etest (bioMe'rieux AB BIODISK) là một phiên bản thương mại có sẵn, sử dụng que thử nhựa mỏng được tẩm lên mặt dưới với một dãy nồng độ kháng sinh khô và được đánh dấu trên bề mặt phía trên. Có đến 5 hoặc 6 dải có thể được đặt trên bề mặt của một thạch thích hợp (150-mm) đã được cấy vi sinh vật theo tiêu chuẩn hóa. Sau khi ủ qua đêm, các kết quả được đọc bằng cách xem các dải từ đầu đĩa. MIC được xác định bởi giao của phần dưới của hình elip (hình vùng ức chế sự tăng trưởng) với que thử. Các phương pháp cột khuếch tán có tính linh hoạt để thử nghiệm các loại thuốc mà phịng thí nghiệm chọn. Nói chung, kết quả Etest có sự tương quan tốt với phương pháp dịch pha loãng MIC hoặc các phương pháp pha loãng agar (Holmes et al., 2015).
2.4.2.3. Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh
Phương pháp sử dụng đĩa kháng sinh được thực hiện bằng cách trải dung dịch chủng có nồng độ 106-108 lên bề mặt thạch Mueller-Hinton. Số lượng đĩa giấy kháng sinh được đặt trên bề mặt thạch cấy phụ thuộc vào kích thước đĩa và khả năng kháng của vi sinh vật đích. Đĩa thạch chứa khoanh giấy kháng sinh được ủ trong 16-24 giờ ở 35°C trước khi đọc kết quả. Các vùng ức chế sự phát triển xung quanh mỗi khoanh giấy kháng sinh được đo đến mm gần nhất. Đường kính của vùng ức chế liên quan đến tính nhạy cảm và tính kháng của vi khuẩn đích. Kết quả đo vùng ức chế sẽ được so sánh với các tiêu chuẩn công bố của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và thí nghiệm (CLSI, trước đây là Ủy ban Quốc gia Tiêu chuẩn lâm sàng trong phịng thí nghiệm hoặc NCCLS) hoặc theo hướng dẫn của FDA. Các kết quả của đĩa cho biết vi khuẩn nhạy cảm, trung gian hoặc kháng với kháng sinh đang thử nghiệm. Những lợi thế của phương pháp đĩa là sự đơn giản trong q trình tiến hành kiểm tra mà khơng cần bất kỳ thiết bị đặc biệt nào, cung cấp kết quả phân loại dễ dàng giải thích bởi tất cả các biểu hiện (nhạy cảm, trung gian, kháng), và linh hoạt trong việc lựa chọn các đĩa kháng sinh để thử nghiệm (Holmes et al., 2015).
Hình 2.4. Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh 2.4.2.4. Phương pháp sử dụng các thiết bị tự động 2.4.2.4. Phương pháp sử dụng các thiết bị tự động
Phương pháp sử dụng các thiết bị đo đạc chuẩn hóa điểm đọc và thường đưa ra kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm trong một thời gian ngắn hơn so với các phương pháp đọc thơng thường vì hệ thống phát hiện quang cho phép phát hiện những thay đổi tinh tế trong sự phát triển của vi khuẩn. Có 4 thiết bị tự
động hiện được cho phép sử dụng bởi FDA. Ba trong số này có thể đưa ra kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm nhanh chóng (3,5-16 h), trong khi thiết bị thứ tư là một hệ thống qua đêm, bao gồm: 1) MicroScan WalkAway (Siemens Healthcare Diagnostics) là một thiết bị ủ ấm và đọc khép kín có thể ủ và phân tích 40-96 khay pha lỗng; 2) BD Phoenix Automated Microbiology System (BD Diagnostics) có với cơng suất xử lý 99 tấm thử nghiệm có chứa 84 giếng dành cho việc pha lỗng gấp đơi kháng sinh và được cấy bằng tay; 3) Hệ thống Vitek 2 (bioMe'rieux) được tự động hóa cao và sử dụng thẻ nhựa thuốc thử rất nhỏ gọn (bằng kích thước thẻ tín dụng) mà chứa lượng lượng kháng sinh và môi trường thử nghiệm trong một định dạng 64 giếng; 4) Các Sensititre ARIS 2X (Trek Chẩn đoán hệ thống) là thiết bị tự động, qua đêm, ủ và đọc kết quả nhanh. Các thiết bị trên đã cung cấp các kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm nhanh có thể dẫn đến nhiều thay đổi kịp thời để thích hợp điều trị kháng sinh, đáng kể tiết kiệm chi phí, khơng cần tiến hành nhiều thao tác. Một trong những thiếu sót của phương pháp thử nghiệm tính nhạy cảm nhanh là khó phát hiện một số loại kháng kháng sinh bao gồm cả β-lactamase cảm ứng và kháng vancomycin.
2.4.2.5. Phương pháp xác định ESBL
Enzyme β-lactamase phổ rộng là enzyme trung gian kháng với cephalosporin phổ mở rộng (thế hệ thứ ba) (ví dụ, ceftazidime, cefotaxime, và ceftriaxone) và monobactams (ví dụ, aztreonam) nhưng không ảnh hưởng đến cephamycins (ví dụ, cefoxitin và cefotetan) hoặc carbapenems (ví dụ, meropenem hoặc imipenem).
Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và thí nghiệm (CLSI) đề nghị nên thực hiện xác nhận kiểu hình các chủng vi khuẩn đường ruột sinh ESBL tiềm năng như K. pneumoniae, K. oxytoca, hoặc E. coli bằng cách kiểm tra cả cefotaxime và ceftazidime, đơn lẻ và kết hợp với axit clavulanic. Thử nghiệm có thể được thực hiện theo phương pháp dịch pha loãng hoặc khuếch tán đĩa. Để thử nghiệm MIC, giảm các độ pha loãng ≥ 3 trong nồng độ pha loãng một nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho hoặc cefotaxime hoặc ceftazidime thử nghiệm kết hợp với 4 mg/ml axit clavulanic, so với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn khi kiểm tra một mình, để khẳng định một sinh vật tạo ESBL. Đối với ổ đĩa thử nghiệm khuếch tán, một sự gia tăng ≥ 5 mm trong đường kính vùng ức chế cho một trong hai tác nhân kháng khuẩn được thử nghiệm kết hợp với axit clavulanic so với khu
vực ức chế khi thử nghiệm một mình xác nhận một vi sinh vật sinh ESBL (Chroma et al., 2015).
Hình 2.5. Xác định vi khuẩn sinh ESBL (A: sinh ESBL, B: không sinh ESBL) (A: sinh ESBL, B: không sinh ESBL)