Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.4.3. Các phương pháp xác định gen mã hóa enzyme β-lactamse
Kỹ thuật di truyền được sử dụng để phát hiện các nhân tố mã hóa enzyme β-lactamase. Kể từ khi phát triển vào năm 1985, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp di truyền cơ bản đã trở thành một công cụ phát hiện mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực khoa học. Trong vi sinh y học, PCR là không chỉ là một kỹ thuật để phát hiện và xác định các tác nhân gây bệnh quan trọng trên con người nmà nó cịn được sử dụng để phát hiện các thuộc tính của các vi sinh vật, chẳng hạn như sức đề kháng và độc tố. Việc xác định tính nhạy cảm kháng sinh của một mầm bệnh là rất quan trọng để có các liệu pháp thích hợp trong điều trọng. Kỹ thuật di truyền khác nhau dựa khuếch đại axit nucleic mục tiêu hoặc sử dụng đầu dò cụ thể đã được phát triển để phát hiện các gen kháng kháng sinh.
2.4.3.1. Đầu dò DNA và oligotyping
Phát hiện sớm các gen β-lactamase được thực hiện bằng đầu dò DNA. Đầu dò dán nhãn với 32P đã được sử dụng để xác định các TEM-1, SHV-1, OXA-1 và OXA-2 (tổ tiên của ESBL).
2.4.3.2. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Phương pháp đơn giản nhất để phát hiện gen mã hóa enzyme β-lactamase là sự khuếch đại của tồn gen mã hóa β-lactamase (gen bla) hoặc các bộ phận của nó bằng PCR với mồi oligonucleotide được cụ thể cho các gen mục tiêu. Các trình tự gen của họ enzyme đơn có sẵn và được cập nhật trong cơ sở dữ liệu cơng
cộng như GenBank (NCBI, 2017). Một số ví dụ về các loại mồi dùng để đánh giá sự hiện diện của blaTEM, blaSHV, blaCTX-M và blaOXA39-42. PCR cho phép xác định các nhóm riêng của β-lactamase nhưng có thể khơng phân biệt được biến thể của các enzyme duy nhất. Do đó, kỹ thuật di truyền khác dựa trên xác định các đột biến điểm cụ thể đã được giới thiệu vào phát hiện ESBL.
2.4.3.3. Phản ứng chuỗi polymerase - đơn sợi đa hình về hình dạng (PCR-SSCP)
Đây là một phương pháp đơn giản và chắc chắn để xác định những thay đổi trình tự DNA được khuếch đại. Phương pháp này được dựa trên quan sát về sự di chuyển của DNA sợi đơn trong gel polyacrylamide gel. Bất kỳ sự khác biệt trong trình tự base của một mẫu ssDNA, do một đột biến hoặc đa hình, sẽ được phát hiện. Các phương pháp PCR-SSCP đã được sử dụng để phát hiện SHV biến thể phát sinh đột biến điểm cụ thể trong gen blaSHV.
2.4.3.4. Phản ứng chuỗi polymerase - Kỹ thuật RFLP (PCR-RFLP)
Các phân tích RFLP cho phép đặc tính của DNA sau khi bị phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn và sự phân tách của các mảnh DNA trong gel Agrose. Enzyme cắt là các enzyme cắt sợi đôi hoặc đơn DNA tại vị trí trình tự nucleotide đặc trưng được gọi là vị trí giới hạn. Sự phân các đoạn DNA khác nhau dựa trên chiều dài đoạn đa hình giới hạn. Đoạn đa hình này xảy ra do sự hiện diện hay vắng mặt vị trí giới hạn. Các phương pháp RFLP cũng đơn giản và nhanh chóng để phát hiện các đột biến được biết đến làm thay đổi địa điểm nhận dạng của enzyme cắt. Enzyme cắt cắt BseDl đã được sử dụng để xác định biến thể của gen mã hóa enzyme CTX-M.
2.4.3.5. Phản ứng chuỗi ligase (LCR)
LCR liên quan đến việc sử dụng hai cặp đầu dò, mỗi cặp là bổ sung cho một sợi DNA biến tính mục tiêu. Mỗi đầu dị trong một cặp được thiết kế để lai và kéo. LCR là phương pháp thích hợp cho việc phát hiện các đột biến điểm, chẳng hạn như những nhân tố mới xuất hiện trong các gen bla.
2.4.3.6. Real-time PCR
Một phương pháp di truyền được sử dụng trong chẩn đoán y tế thực tế là kỹ thuật Real-time PCR. Ưu điểm của phương pháp là giảm thời gian chu kỳ, loại bỏ các hoạt động phân tích tiếp theo sau khi PCR phát hiện và sử dụng các thiết bị phát hiện huỳnh quang nhạy cảm, cho phép phát hiện sự khuếch đại trước đó. Khơng giống như PCR thơng thường, real-time PCR cho phép kiểm sốt liên
tục sự khuếch đại trong thời gian khuếch đại bằng cách dán nhãn mồi, dán nhãn đầu dò oligoprobes hoặc khuếch đại với các phân tử có khả năng phát huỳnh quang. Có một số loại phát hiện dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang (như SybrGreen hoặc LCGreen, đầu dò kép dán nhãn, hệ thống dò FRET) được sử dụng trong thời gian khuếch đại Real-time PCR với phân tích đường cong nóng chảy ứng dụng thực tế trong. Kỹ thuật này đã được sử dụng vào việc phát hiện ben bla SHV phổ rộng B-lactam.
2.4.3.7. DNA microarray
Nhược điểm chính của phương pháp trên là số lượng hạn chế các mục tiêu có thể được phát hiện và phân biệt trong mỗi phản ứng. DNA microarray có vẻ là một kỹ thuật kiểu gen hứa hẹn với khả năng đa dạng cao. Thay vì phát hiện và nghiên cứu một gen tại một thời điểm, microarray cho phép hàng ngàn hoặc hàng chục ngàn các trình tự DNA cụ thể được phát hiện đồng thời trên một lần chạy. Microarray DNA được sử dụng trong ba lĩnh vực lâm sàng chính: (a) biểu hiện gene profiling - đo lường mức độ biểu hiện của hàng ngàn gen trong bất kỳ mẫu mô, (b) cho kiểu gen - xác định gen liên quan đến bệnh hoặc các tác nhân gây bệnh, và (c) giải trình tự DNA- sàng lọc hàng ngàn cặp base DNA đột biến trong gen cụ thể mà bình thường trình tự đã được biết đến (sàng lọc đa hình nucleotide, SNPs). Nhiều báo cáo cho thấy sự phát triển và xác nhận sử dụng phương pháp DNA microarray cho việc xác định nhanh chóng của ESBL ở vi khuẩn Gram âm bằng cách đồng thời kiểu gen blaTEM, blaSHV và blaCTX-M.
2.4.3.8. Giải trình tự trực tiếp
Giải trình tự trực tiếp vẫn là tiêu chuẩn vàng để xác định các sản phẩm không rõ phản ứng khuếch đại. Dụng cụ bây giờ đã có để chạy tồn bộ hệ gen và dự đốn các biến thể có thể có. Vì vậy, bất kỳ gen kháng hoặc đột biến kháng có thể được xác định bằng phương pháp này.