Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Phương pháp phân lập Salmonella
3.3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị, dụng cụ
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản) - Tủ sấy (Memmert, Đức)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ) - Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ) - Tủ ấm (Binder, Đức)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản) - Tủ lạnh (Panasonic, Malaysia) - Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha) - Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- Máy vortex (IKA, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.10C đơn vị pH ở 200C hoặc 250C (Thụy Sĩ) - Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vịng vơ trùng, có đường kính 3 mm hoặc 10µl - Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vơ trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam - Đèn cồn
- Lam kính Mơi trường, thuốc thử
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức) - MKTTn broth (BD, Pháp)
- RV broth (Merck, Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức) - TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức) - TSA (Merck, Đức)
3.3.2.2. Nội dung phương pháp
Chúng tôi lựa chọn phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) – Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch – để phân tích và phân lập chủng Salmonella do đây là phương pháp đang được tiến hành tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, và đã được đánh giá công nhận bởi Văn phịng cơng nhận chất lượng (BOA).
a/ Nguyên lý
Salmonella có thể có mặt với số lượng nhỏ và thường kèm theo một lượng khá lớn các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteria hoặc các họ khác. Do đó, cần tăng sinh sơ bộ để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella bị suy giảm hoạt tính (TCVN 4829:2005) (Tiêu chuẩn Việt Nam 4829, 2005).
Sau khi tăng sinh sơ bộ, số lượng, hoạt tính của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên, tiến hành tăng sinh chọn lọc tạo điều kiện ức chế những vi khuẩn khác. Những khuẩn lạc Salmonella điển hình được tiến hành thử các phản ứng sinh hóa và thử kháng huyết thanh dựa bằng thử ngưng kết trên phiến kính.
b/ Chủng chuẩn đối chứng trong q trình phân tích
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076 − Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922
c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vơ trùng - Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 18h ± 2h. Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
- Từ dịch tăng sinh sau khi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 18h ± 2h ở bước 1, chuyển 0.1 ml sang 10 ml RV broth (nuôi ở 41.50C ± 10C trong 24h ± 3h) và 1 ml sang 10 ml MKTTn broth (ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h). Bước 3: Ria dịch đã tăng sinh ở bước 2 lên môi trường thạch thứ nhất XLD agar, để yên 30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.. Làm tương tự với môi trường thạch thứ hai HE agar, để yên 30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.
Bước 4: Bắt khuẩn lạc điển hình (khuẩn lạc rìa hồng, tâm đen, nhẵn bóng, lồi, trịn trên XLD agar; và khuẩn lạc rìa khơng màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi trịn trên HE agar) nuôi trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24h ± 3h.
Hình 3.3. Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD
Bước 5: Thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định
- Thạch TSI nghiêng trong ống nghiệm: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, cấy đường cấy trích sâu đâm vào thạch TSI, sau đó cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch; ni ở nhiệt độ 370C ± 10C qua đêm. Trên thạch TSI có các tính chất điển hình của Salmonella: thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với khoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen).
+ Cấy đâm sâu: Màu vàng (glucoza dương tính), màu đỏ hoặc khơng đổi màu (glucoza âm tính), màu đen (sinh khí hydro sunfua), bọt hoặc vết rạn (sinh khí từ glucoza)
+ Bề mặt thạch nghiêng: Màu vàng (lactoza và/hoặc sucroza dương tính), màu đỏ hoặc khơng đổi màu (lactoza và sucroza âm tính)
Hình 3.4. Kết quả phản ứng trên thạch TSI
Khuẩn lạc điển hình
- Ure broth: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch Ure broth trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ 370C ± 10C qua đêm. Nếu phản ứng là dương tính, thì sự phân giải urê thành amoniac, làm phenol màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Phản ứng thường xuất hiện sau 2 đến 4 giờ.
Hình 3.5. Phản ứng trên Urea broth
- LDC: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch LDC trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ 370C ± 10C qua đêm. Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính, ; màu vàng là phản ứng âm tính.
Hình 3.6. Phản ứng trên LDC broth
Bước 6: Khẳng định bằng huyết thanh học các chủng Salmonella phân lập được bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo Kauffmann White Scheme: loại bỏ
Ure broth Âm tính Salmonella Dương tính Salmonella Âm tính Salmonella Dương tính Salmonella LDC
các chủng tự ngưng kết bằng cách thực hiện phản ứng ngưng kết với nước muối. Sau đó kiểm tra kháng nguyên O, kháng nguyên H.
Để tiến hành phân typ các chủng thì cần ria các chủng phân lập được lên thạch dinh dưỡng, ủ 370C trong 18 giờ.
+ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% làm đối chứng lên phiến kính bằng cách sử dụng vịng que cấy.
+ Lấy khuẩn lạc đã ria trên thạch dinh dưỡng lên phiến kính và trộn đều với giọt nước muối sinh lý.
+ Đợi cho phản ứng ngưng kết diễn ra trong 30 giây để kiểm tra tính tự ngưng kết của chủng. Đối với những chủng tự ngưng kết sẽ không tiến hành các bước định typ tiếp theo. Đối với những chủng không tự ngưng kết, tiếp tục tiến hành các phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể.
Kiểm tra kháng nguyên O:
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào mỗi vùng kiểm tra trên phiến kính. Sau đó cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh. Trộn đều cẩn thận kháng huyết thanh và chủng. Lắc nhẹ nhàng phiến kính trong 30 giây. Quan sát phản ứng xảy ra.
Kiểm tra kháng nguyên H:
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào mỗi vùng kiểm tra trên phiến kính. Sau đó cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh. Trộn đều cẩn thận kháng huyết thanh và chủng. Lắc nhẹ nhàng phiến kính trong 30 giây. Quan sát phản ứng xảy ra.
3.3.2.3. Pha chế môi trường
Pha chế môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mơi trường trước khi sử dụng được kiểm sốt chất lượng theo TCVN 8128-1,2 : 2009
Trong mọi trường hợp, tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về các điều kiện bảo quản, hạn sử dụng và cách bảo quản.
Đối với mơi trường được chuẩn bị trong phịng thí nghiệm, bảo quản mơi trường trong điều kiện tránh được mọi thay đổi về thành phần môi trường, tránh ánh sáng và tránh bị khô và bảo quản ở 50C ± 30C, nếu cần. Với các đĩa môi trường, bảo quản không quá 2 tuần đến 4 tuần và đối với các ống hoặc lọ nhỏ thì khơng q 3 tháng đến 6 tháng, trừ khi có qui định trong các tiêu chuẩn riêng
hoặc các kết quả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phịng thí nghiệm cho thấy lâu hơn.
Mơi trường được bổ sung các thành phần khơng ổn định thì cần được sử dụng trong ngày, trừ khi có qui định trong các tiêu chuẩn riêng hoặc các kết quả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phịng thí nghiệm cho thấy lâu hơn. Môi trường đặc có chứa các chất khơng ổn định và/ hoặc các chất hoạt hóa khơng được bảo quản với lượng lớn để làm tan chảy lại.
Thiết lập hạn sử dụng có hiệu lực cho mơi trường được bảo quản. Quan sát mọi dấu hiệu của thay đổi về màu sắc, bay hơi/ khơ hoặc có vi khuẩn phát triển. Các mẻ mơi trường có các dấu hiệu thay đổi kể trên thì khơng được sử dụng.
Trước khi sử dụng hoặc làm nóng tiếp, cần hạ nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến nhiệt độ môi trường xung quanh.
3.3.3. Phương pháp kháng sinh đồ 3.3.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị, dụng cụ
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản) - Tủ sấy (Memmert, Đức)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ) - Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ) - Tủ ấm (Binder, Đức)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha) - Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- Máy vortex (IKA, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.10C đơn vị pH ở 200C hoặc 250C (Thụy Sĩ) - Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vịng vơ trùng, có đường kính 3 mm hoặc 10µl - Ống nghiệm, đĩa petri vơ trùng
- Đèn cồn
- Tăm bông vô trùng Môi trường, thuốc thử
- Khoanh giấy kháng sinh: cefazoline, cefoxitin, cefuroxime, ceftriaxone, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefotaxime /Clavulanic axit, Ceftazidime /Clavulanic axit (xuất xứ Anh và Italia)
- McFaland (BaCl2, H2SO4: Merck, Đức).
3.3.3.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh
a/ Nguyên lý:
Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Muller- Hinton có chứa vi khuẩn thử nghiệm; mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
b/ Cách tiến hành
Tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Salmonella được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của WHO(31)
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch McFaland và tạo dung dịch chủng Salmonella: 106 – 108
Chuẩn bị độ đục chuẩn McFarland.
Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.
Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng cách trộn:
Dung dịch BaCl2.2H2O 1%: 0,5ml
Dung dịch H2SO4 1%: 99,5 ml
+ Chia vào các tube và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn này có thể giữ trong vịng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phịng.
+ Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO4 kết tủa trong tube. + Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland.
Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn
- Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chuẩn trước 1 ngày cần được cấy vào môi trường thạch dinh dưỡng để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
- Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.
- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen. Lưu ý, cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi dùng.
- Nếu huyền dịch vi khuẩn khơng có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.
- Pha lỗng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl huyền dịch này cho vào 2ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml.
- Ngồi ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường canh thang Mueller-Hinton. Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.
Bước 2: Sử dụng tăm bông khử trùng trải huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
Bước 3: Đặt khoanh giấy kháng sinh: Hong khô và đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh, khoang giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi dàn vi khuẩn lên đĩa thạch, để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh được đặt từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ở (37±1)0C/16 – 18 giờ.
Bước 4: Đọc và phân tích kết quả: Sau khi ủ lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vịng vơ khuẩn (dùng thước kẹp đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vịng vơ khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế theo tiêu chuẩn CLSI 2014, sau đó ghi lại kết quả đường kính vịng ức chế vi khuẩn của từng loại kháng sinh được thử nghiệm: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R), đối chiếu với kích thước của chủng đối chiếu (E. Coli ATCC 25922) theo hướng dẫn của tổ chức CLSI về chuẩn kháng kháng sinh (32).
Chủng kháng cephalosporin thế hệ 3 sẽ được khẳng định có phải là chủng kháng B-lactam mở rộng bằng phân tích đồng thời 4 kháng sinh Cefotaxime, Ceftazidime, Cefotaxime/Calvulanic axit, Ceftazidime/Clavulanic axit.
Các kháng sinh đã sử dụng và điểm đọc kháng sinh đồ được thể hiện trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tên kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ
Kháng sinh Tên viết
tắt
Nồng độ
kháng sinh Điểm đọc tiêu chuẩn (mm)
S (Nhạy cảm) I (Trung bình) R (Kháng) Cephalosporin thế hệ 1 Cefazoline CZ 30 ≥15 - ≤14 Cephalosporin thế hệ 2 Cefuroxime Cefoxitin CXM FOX 30 30 ≥18 ≥18 15-17 15-17 ≤14 ≤14 Cephalosporin thế hệ 3 Ceftriaxone Cefotaxime Ceftazidime CRO CTX CAZ 30 30 30 ≥23 ≥26 ≥21 20-22 23-25 18-20 ≤19 ≤22 ≤17 Quá trình tiến hành kháng sinh đồ được thực hiện song song với chủng chứng dương E. coli ATCC 25922 để xác định kích thước theo hướng dẫn của CLSI và sử dụng chủng Salmonella mã số 572, đã được thu thập trên gia cầm năm 2012, và được xác định là kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2, 3 để đối chiếu kết quả dương (Hình 3.7. và 3.8.).
A: Vịng kháng sinh tẩm CTX B: Vòng kháng sinh tẩm CTL C: Vòng kháng sinh tẩm CAZ D: Vòng kháng sinh tẩm CAL E: Vòng kháng sinh tẩm CRO F: Vòng kháng sinh tẩm CXM G: Vòng kháng sinh tẩm FOX H: Vịng kháng sinh tẩm CZ
Hình 3.7. Kháng sinh đồ trên chủng dương đối chiếu Salmonella 572
Hình 3.8. Kháng sinh đồ trên chủng đối chiếu E.coli ATCC 52922
Xử lý số liệu:
- Tính kháng kháng sinh được xử lý theo phương pháp chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
- Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel.
A B F E C D G H H F G F